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★人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。

3.PCR技术扩增目的基因

(1)PCR的含义:

是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。

(2)目的:

获取大量的目的基因

(3)原理:

DNA双链复制

(4)过程:

加热至90~95℃DNA解链;

第二步:

冷却到55~60℃,引物结合到互补DNA链;

第三步:

加热至70~75℃,热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。

(5)特点:

指数形式扩增

基因表达载体的构建

1.目的:

使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传至下一代,使目的基因能够表达和发挥作用。

2.组成:

目的基因+启动子+终止子+标记基因

(1)启动子:

是一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的首端,是RNA聚合酶识别和结合的部位,能驱动基因转录出mRNA,最终获得所需的蛋白质。

(2)终止子:

也是一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的尾端。

(3)标记基因的作用:

是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来。

常用的标记基因是抗生素基因。

将目的基因导入受体细胞_

1.转化的概念:

是目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

2.常用的转化方法:

将目的基因导入植物细胞:

采用最多的方法是农杆菌转化法,其次还有基因枪法和花粉管通道法等。

将目的基因导入动物细胞:

最常用的方法是显微注射技术。

此方法的受体细胞多是受精卵。

将目的基因导入微生物细胞:

3.重组细胞导入受体细胞后,筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。

第四步:

目的基因的检测和表达

1.首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因,方法是采用DNA分子杂交技术。

2.其次还要检测目的基因是否转录出了mRNA,方法是采用用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。

3.最后检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法是从转基因生物中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原-抗体杂交。

4.有时还需进行个体生物学水平的鉴定。

如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。

(四)(b)基因工程的应用

1.植物基因工程:

抗虫、抗病、抗逆转基因植物,利用转基因改良植物的品质。

2.动物基因工程:

提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物。

3.基因治疗:

把正常的外源基因导入病人体内,使该基因表达产物发挥作用。

区分:

基因诊断:

又称为DNA诊断,是采用基因检测的方法来判断患者是否出现了基因异常或携带病原体。

基因治疗:

指利用正常基因置换或弥补缺陷基因的治疗方法。

实例:

ADA基因缺陷症的基因治疗

(五)(a)蛋白质工程的概念

蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础,通过基因修饰或基因合成,对现有蛋白质进行改造,或制造一种新的蛋白质,以满足人类的生产和生活的需求。

(基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质)

(1)蛋白质工程崛起的缘由:

基因工程只能生产自然界已存在的蛋白质

(2)蛋白质工程的基本原理:

它可以根据人的需求来设计蛋白质的结构,又称为第二代的基因工程。

基本途径:

从预期的蛋白质功能出发,设计预期的蛋白质结构,推测应有的氨基酸序列,找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)以上是蛋白质工程特有的途径;

以下按照基因工程的一般步骤进行。

(注意:

目的基因只能用人工合成的方法)设计中的困难:

如何推测非编码区以及内含子的脱氧核苷酸序列

二、细胞工程

(一)植物细胞工程

1.理论基础(原理):

细胞全能性

全能性表达的难易程度:

受精卵>生殖细胞>干细胞>体细胞;

植物细胞>动物细胞

2.植物组织培养技术(b)

(1)过程:

离体的植物器官、组织或细胞―――→愈伤组织―――→试管苗――→植物体

(2)用途:

微型繁殖、作物脱毒、制造人工种子、单倍体育种、细胞产物的工厂化生产。

A植物繁殖

微型繁殖:

可以高效快速地实现种苗的大量繁殖

作物脱毒:

采用茎尖组织培养来除去病毒(因为植物分生区附近的病毒极少或没有)

人工种子:

以植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等为材料,经人工薄膜包装得到的种子。

优点:

完全保持优良品种的遗传特性,不受季节的限制;

方便储藏和运输

B作物新品种培育——单倍体育种:

a过程:

植株(AaBb)通过减数分裂得到花粉(AB、Ab、aB、ab四种类型);

对花粉进行花药离体培养(技术是植物组织培养);

得到单倍体植株;

对其幼苗时期进行秋水仙素处理;

得到了正常的纯合二倍体植株(AABB、AAbb、aaBB、aabb四种类型)。

b优点:

明显缩短育种年限

C突变体利用:

在组织培养中会出现突变体,通过从有用的突变体中选育出新品种(如筛选抗病、抗盐、含高蛋白的突变体)

D细胞产物的生产:

通过能够产生对人们有利的产物的细胞进行组织培养,从而让它们能够产生大量的细胞产物。

(3)地位:

是培育转基因植物、植物体细胞杂交培育植物新品种的最后一道工序。

3.植物体细胞杂交技术

 

(2)诱导融合的方法:

物理法包括离心、振动、电刺激等。

化学法一般是用聚乙二醇(PEG)作为诱导剂。

(3)意义:

克服了远缘杂交不亲和的障碍。

(二)动物细胞工程

1.动物细胞培养(a)

(1)概念:

动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和繁殖。

(2)动物细胞培养的流程:

取动物组织块(动物胚胎或幼龄动物的器官或组织)→剪碎→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。

(3)细胞贴壁和接触抑制:

悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上,称为细胞贴壁。

细胞数目不断增多,当贴壁细胞分裂生长到表面相互抑制时,细胞就会停止分裂增殖,这种现象称为细胞的接触抑制。

(4)动物细胞培养需要满足以下条件

①无菌、无毒的环境:

培养液应进行无菌处理。

通常还要在培养液中添加一定量的抗生素,以防培养过程中的污染。

此外,应定期更换培养液,防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。

②营养:

合成培养基成分:

糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。

通常需加入血清、血浆等天然成分。

③温度:

适宜温度:

哺乳动物多是36.5℃+0.5℃;

pH:

7.2~7.4。

④气体环境:

95%空气+5%CO2。

O2是细胞代谢所必需的,CO2的主要作用是维持培养液的pH。

(5)动物细胞培养技术的应用:

制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培养医学研究的各种细胞。

2.动物体细胞核移植技术和克隆动物

(1)哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植(比较容易)和体细胞核移植(比较难)。

(2)选用去核卵(母)细胞的原因:

卵(母)细胞比较大,容易操作;

卵(母)细胞细胞质多,营养丰富。

(3)体细胞核移植的大致过程是:

高产奶牛(提供体细胞)进行细胞培养;

同时采集卵母细胞,在体外培养到减二分裂中期的卵母细胞,去核(显微操作)[注:

为什么要用卵细胞?

它可以提供充足的营养;

操作简便;

细胞质不会抑制细胞核全能性的表达];

将供体细胞注入去核卵母细胞;

通过电刺激使两细胞融合,供体核进入受体卵母细胞,构建重组胚胎;

将胚胎移入受体(代孕)母牛体内;

生出与供体奶牛遗传基因相同的犊牛

(4)体细胞核移植技术的应用:

①加速家畜遗传改良进程,促进良畜群繁育;

②保护濒危物种,增大存活数量;

③生产珍贵的医用蛋白;

④作为异种移植的供体;

⑤用于组织器官的移植等。

(5)体细胞核移植技术存在的问题:

克隆动物存在着健康问题、表现出遗传和生理缺陷等。

3.动物细胞融合

(1)动物细胞融合也称细胞杂交,是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。

融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞,称为杂交细胞。

(2)动物细胞融合与植物原生质体融合的原理基本相同,诱导动物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方法类似,常用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒、电刺激等。

(3)动物细胞融合的意义:

克服了远缘杂交的不亲和性,成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物生物新品种培育的重要手段。

(4)动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较:

细胞工程

植物体细胞杂交

动物细胞融合

理论基础

细胞的全能性、细胞膜的流动性

细胞增殖、细胞膜的流动性

融合前处理

酶解法去除细胞壁(纤维素酶、果胶酶)

注射特定抗原,免疫处理正常小鼠

诱导手段

物理法:

离心、振动、电激

化学法:

聚乙二醇(PEG)

聚乙二醇

生物法:

灭活的病毒(灭活的仙台病毒)

诱导过程

原生质体的制备(酶解法)

原生质体融合(物、化法)

杂种细胞的筛选和培养

杂种植株的诱导与鉴定

正常小鼠免疫处理

动物细胞的融合(物、化、生法)

杂交瘤细胞的筛选与培养

专一抗体检验阳性细胞培养

单克隆抗体的提纯

用途和意义

克服远缘杂交的不亲和障碍,大大扩展杂交的亲本组合范围

应用:

白菜-甘蓝等杂种植株

(1)制备单克隆抗体

(2)诊断、治疗、预防疾病,例如“生物导弹”治疗癌症

4.单克隆抗体

(1)抗体:

一个B淋巴细胞

只分泌一种特异性抗体。

从血

清中分离出的抗体产量低、纯

度低、特异性差。

(2)单克隆抗体的制备过程:

对免疫小鼠注射特定的抗原蛋白

(目的使小鼠产生了效应B细胞);

提取B淋巴细胞;

同时用动物细胞

培养的方法培养骨髓瘤细胞并提取;

促使它们细胞融合[注:

融合的结果

是有很多不符合要求的;

如有2个

B淋巴细胞融合的细胞等,所以要进行筛选];

在特定的选择培养基上筛选出融合的

杂种细胞[特点是能迅速大量增殖,

又能产生专一的抗体];

然后对它进行

克隆化培养和抗体检测[筛选出能够分泌所需抗体的杂种细胞];

最后将杂交瘤细胞在体外做大规模培养或注射入小鼠腹腔内增殖,从细胞培养液或小鼠腹水中可得到大量的单克隆抗体。

(3)杂交瘤细胞的特点:

既能大量繁殖,又能产生专一的抗体。

(4)单克隆抗体的优点:

特异性强,灵敏度高,并能大量制备。

(5)单克隆抗体的作用:

作为诊断试剂:

准确识别各种抗原物质的细微差异,并跟一定抗原发生特异性结合,具有准确、高效、简易、快速的优点。

用于治疗疾病和运载药物:

主要用于治疗癌症治疗,可制成“生物导弹”,也有少量用于治疗其它疾病。

三、胚胎工程

(一)动物胚胎发育的基本过程

1、精子的发生:

精原细胞先进行有丝分裂后进行减数分裂,最后形成4个精细胞,变形过程中,细胞核为精子头的主要部分,高尔基体发育为顶体,中心体演变为精子的尾,线粒体在尾基部形成线粒体鞘膜,其他物质浓缩为原生质滴直至脱落。

[线粒体为精子运动提供能量]最终形成精子。

产生部位:

睾丸的曲细精管;

储存部位:

曲细精管的管腔中;

营养来源:

支持细胞。

2、卵子的发生:

在胎儿时期,卵原细胞进行有丝分裂演变成初级卵母细胞[被卵泡细胞包围],减一分裂在排卵前后完成,形成次级卵母细胞和第一极体进入输卵管准备受精;

减二分裂是在受精过程中完成的。

形成1个卵子和1个第二极体,最终结果产生1个卵子和3个第二极体。

3、受精过程:

(1)精子获能精子在附睾中成熟后必须在雌性动物生殖道内经历一段时间才能获得受精能力的过程。

卵泡液、输卵管分泌物、血清等液体可使精子获能。

(2)卵子的准备(排出的卵子要在输卵管中进一步成熟到减二中期才具备受精能力);

(3)受精阶段[卵子周围的结构由外到内:

放射冠、透明带、卵黄膜],

a顶体反应:

精子释放顶体酶溶解卵丘细胞之间的物质,穿越放射冠。

b透明带反应:

顶体酶可将透明带溶出孔道,精子穿入,在精子触及卵黄膜的瞬间阻止后来精子进入透明带的生理反应[它是防止多精子入卵受精的第一道屏障];

c卵黄膜的封闭作用:

精子外膜和卵黄膜融合,精子入卵后,卵黄膜会拒绝其他精子再进入卵内的过程[它是防止多精子入卵受精的第二道屏障];

精子尾部脱落,原有核膜破裂形成雄原核,同时卵子完成减二分裂,形成雌原核[注意:

受精标志是第二极体的形成;

受精完成标志是雌雄原核融合成合子]。

(4)受精作用的定义:

卵细胞和精子相互识别、融合成为受精卵的过程。

(5)受精作用的场所:

输卵管的壶腹部

(6)受精标志:

第二极体的形成;

受精完成标志是雌雄原核融合成合子。

(7)受精作用的结果:

使单倍体的精子和卵子结合形成二倍体的受精卵,染色体数目恢复到体细胞中的数目,其中一半染色体来自父方,另一半来自母方。

(8)减数分裂和受精作用的意义:

对于维持每种生物前后代体细胞中染色体数目的恒定,对于生物的遗传和变异,都是十分重要的。

受精过程的完成,标志着胚胎发育的开始。

4、胚胎发育:

起点:

受精卵;

终点:

幼体;

a卵裂期:

细胞有丝分裂,细胞数量不断增加,但胚胎的总体体积并不增加,或略有减小。

b桑椹胚:

胚胎细胞数目达到32个左右时,胚胎形成致密的细胞团,形似桑椹。

[之前所有细胞都能发育成完整胚胎的潜能属全能细胞];

c囊胚:

细胞开始分化(该时期细胞的全能性仍比较高),聚集在胚胎一端个体较大的细胞称为内细胞团,将来发育成胎儿的各种组织;

而滋养层细胞将来发育成胎膜和胎盘;

胚胎内部逐渐出现囊胚腔[注:

囊胚的扩大会导致透明带的破裂,胚胎伸展出来,这一过程叫孵化];

d原肠胚:

内细胞团表层形成外胚层,下方细胞形成内胚层,由内胚层包围的囊腔叫原肠腔。

[细胞分化在胚胎期达到最大限度]

(二)胚胎工程的概念及技术手段

对动物生殖细胞、受精卵和早期胚胎细胞所进行的多种显微操作和处理技术,由体外受精技术、胚胎移植技术、胚胎分割技术、胚胎干细胞培养、胚胎冷冻保存技术和性别控制技术等组成的现代生物技术。

胚胎发育学是胚胎工程的理论基础。

(1)体外受精技术

是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。

[属有性生殖过程]

基本原理:

人工模拟体内环境,包括营养、温度、pH等,使初级卵母细胞成熟,同时使精子获能,最终完成受精作用,并有计划地保存胚胎等。

卵母细胞的采集和培养对体型小的动物用促性腺激素处理,从输卵管冲取卵子(可直接受精);

对体型大的动物从卵巢中采集卵母细胞(要在体外培养成熟)。

精子的采集假阴道法、手握法和电刺激法;

获能对啮齿动物、兔、猪等的精子用培养法(放入人工配制的获能液中);

对牛、羊等精子用化学法(放在肝素或钙离子载体溶液中)

胚胎的早期培养:

a培养液成分:

无机盐、有机盐、维生素、激素、氨基酸、核苷酸、血清等[注意与动物细胞培养液成分的比较];

b当胚胎发育到适宜的阶段时,可将其取出向受体移植或冷冻保存。

体外受精技术是哺乳动物胚胎移植技术、克隆技术、转基因技术和性别控制技术不可缺少的组成部分。

(2)胚胎移植技术

a概念:

将雌性动物的早期胚胎移植到同种的、生理状态相同的其他雌性动物的体内,使之继续发育为新个体的技术。

是生产胚胎的供体和孕育胚胎的受体共同繁殖后代的过程,通过转基因、核移植、体外受精获得的胚胎必须移植给受体才能获得后代。

b优势:

可以充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力,缩短供体本身的繁殖周期。

c胚胎移植的生理学基础:

同种动物的供、受体生殖器官的生理变化是相同的[对供体和受体进行同期发情处理];

早期胚胎形成后处于游离状态,为胚胎的收集提供可能;

受体对移入子宫的外来胚胎基本不发生免疫排斥反应;

移入受体的供体胚胎的遗传特性在孕育过程中不受影响。

d胚胎移植的程序:

①对供、受体母牛进行选择,用激素进行同期发情处理;

②对供体母牛用激素做超数排卵处理;

③选择同种优秀公牛配种[有性生殖过程];

④对胚胎进行收集[此时胚胎处于游离状态];

⑤对胚胎进行质量检查[此时胚胎应发育到桑椹胚或囊胚];

胚胎移植[或冷冻保存];

⑥检查受体母牛是否受孕;

⑦产下胚胎移植的犊牛。

(3)胚胎分割技术

用显微手术方法将早期胚胎切割成2、4、8等份,经体内或体外培养后植入受体,以获得同卵双生或同卵多生后代的技术[可看作是动物无性繁殖或克隆]。

b基本过程:

选择良好的桑椹胚或囊胚移入培养皿中,用分割针或分割刀片将其切开,吸出其中的半个胚胎注入透明带中或直接移植给受体。

[注意:

内细胞团要均等分割,否则会影响胚胎的恢复和进一步发育]

(4)胚胎冷冻保存技术

将动物的早期胚胎,通过特殊的保护剂和降温措施,使其长期保存在超低温环境下。

B优势:

可以使胚胎移植不受时间和地域的限制,简化引种过程。

(5)动物性别控制技术

指通过人为干预,使动物按照人们的愿望繁衍所需性别的后代的技术。

(6)胚胎干细胞的移植(识记)

①胚胎干细胞的含义:

由早期胚胎[囊胚]或原始性腺[胎儿]中分离出来的一类细胞,又叫ES或EK细胞。

干细胞:

动物(包括人)胚胎及某些器官中具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞,是重建、修复病损或衰老组织、器官功能的种子细胞。

按照分化潜能的大小,干细胞基本上可分为专能干细胞(只能分化成一种类型或功能密切相关的两种类型的细胞)、多能干细胞(具有分化成多种细胞或组织的潜能却失去发育成完全个体能力的细胞)和全能干细胞(可以分化为全身各种细胞,并进一步形成机体的所有组织、器官)。

成体干细胞:

存在于胎儿、儿童和成人组织中的多能干细胞。

造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源,主要存在于骨髓、脐血、外周血中。

胚胎干细胞:

具有增殖能力并保持未分化状态、在一定的条件下可以向各种组织和器官分化、易于进行基因改造操作等特点。

如内细胞团细胞(位于囊胚的囊胚腔一侧)

②特征:

形态上体积小、细胞核大、核仁明显;

功能上具有发育的全能性,即可分化为成年动物体内任何一种组织细胞。

另外,在体外培养的条件下,可以增殖而不发生分化,可进行冷冻保存,也可进行遗传改造。

③胚胎干细胞的主要用途是:

A可用于研究哺乳动物个体发生和发育规律;

B是在体外条件下研究细胞分化的理想材料,在培养液中加入分化诱导因子,如牛黄酸等化学物质时,就可以诱导ES细胞向不同类型的组织细胞分化,这为揭示细胞分化和细胞凋亡的机理提供了有效的手段;

C可以用于治疗人类的某些顽疾,如帕金森综合症、少年糖尿病等;

D利用可以被诱导分化形成新的组织细胞的特性,移植ES细胞可使坏死或退化的部位得以修复并恢复正常功能;

E随着组织工程技术的发展,通过ES细胞体外诱导分化,定向培育出人造组织器官,用于器官移植,解决供体器官不足和器官移植后免疫排斥的问题。

胚胎干细胞及其研究进展,在法律、伦理、国家和社会安全等方面带来冲击。

(三)胚胎工程的应用

1.体外受精和胚胎的早期培养

(1)卵母细胞的采集和培养:

主要方法:

用促性腺激素处理,使其排出更多的卵子,然后,从输卵管中冲取卵子,直接与获能的精子在体外受精。

第二种方法:

从刚屠宰母畜的卵巢中采集卵母细胞;

第三种方法是借助超声波探测仪、腹腔镜等直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞。

采集的卵母细胞,都要在体外经人工培养成熟后,才能与获能的精子受精。

(2)精子的采集和获能:

在体外受精前,要对精子进行获能处理。

(3)受精:

获能的精子和培养成熟的卵细胞在获能溶液或专用的受精溶液中完成受精过程。

(4)胚胎的早期培养:

精子与卵子在体外受精后,应将受精卵移入发育培养液中继续培养,以检查受精状况和受精卵的发育能力。

培养液成分较复杂,除一些无机盐和有机盐外,还需添加维生素、激素、氨基酸、核苷酸等营养成分,以及血清等物质。

当胚胎发育到适宜的阶段时,可将其取出向受体移植或冷冻保存。

不同动物胚胎移植的时间不同。

(牛、羊一般要培育到桑椹胚或囊胚阶段才能进行移植,小鼠、家兔等实验动物可在更早的阶段移植,人的体外受精胚胎可在4个细胞阶段移植。

2.胚胎移植

(1)胚胎移植是指将雌性动物的早期胚胎,或者通过体外受精及其它方式得到的胚胎,移植到同种的、生理状态相同的其它雌性动物的体内,使之继续发育为新个体的技术。

其中提供胚胎的个体称为“供体”,接受胚胎的个体称为“受体”。

(供体为优良品种,作为受体的雌性动物应为常见或存量大的品种。

地位:

如转基因、核移植,或体外受精等任何一项胚胎工程技术所生产的胚胎,都必须经过胚胎移植技术才能获得后代,是胚胎工程的最后一道“工序”。

(2)胚胎移植的意义:

大大缩短了供体本身的繁殖周期,充分发挥雌性优良个体的繁殖能力。

(3)生理学基础:

①动物发情排卵后,同种动物的供、受体生殖器官的生理变化是相同的。

这就为供体的胚胎移入受体提供了相同的生理环境。

②早期胚胎在一定时间内处于游离状态。

这就为胚胎的收集提供了可能。

③受体对移入子宫的外来胚胎不发生免疫排斥反应。

这为胚胎在受体的存活提供了可能。

④供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系,但供体胚胎的遗传特性在孕育过程中不受影响。

(4)基本程序主要包括:

①对供、受体的选择和处理。

选择遗传特性和生产性能优秀的供体,有健康的体质和正常繁殖能力的受体,供体和受体是同一物种。

并用激素进行同期发情处理,用促性腺激素对供体母牛做超数排卵处理。

②配种或人工授精。

③对胚胎的收集、检查、培养或保存。

配种或输精后第7天,用特制的冲卵装置,把供体母牛子宫内的胚胎冲洗出来(也叫冲卵)。

对胚胎进行质量检查,此时的胚胎应发育到桑椹或胚囊胚阶段。

直接向受体移植或放入-196℃的液氮中保存。

④对胚胎进行移植。

⑤移植后的检查。

对受体母牛进行是否妊娠的检查。

3.胚胎分割

是指采用机械方法将早期胚

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