微生物计数USP61中文版Word格式文档下载.docx
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(3)结合
(1)、
(2)得出适当条件,使接种物得以生长。
以下是一些物质的成分和浓度,该物质及浓度可用于加入培养基、阻止物质发挥抑菌作用:
大豆卵磷脂(soylecithin,0.5%)或者聚山梨醇酯20(polysorbate20,4.0%)。
然后重复前面的实验,用液体酪蛋白消化物-大豆卵磷脂-聚山梨醇酯20(FluidCaseinDigest-Soylecithin-Polysorbate20Medium)论证待测样品里的防腐剂或其他抑菌因子被中和。
若产品中含有抑菌物质且产品是可溶性的,则采用“无菌实验(SterilityTests<
71>
)”里的“薄膜过滤法(MembraneFiltrationMethod)”进行(微生物限度)检测会更适宜(suitable)。
在抑菌物质得以适当中和、稀释液体积大幅度增加后仍不能排除抑制因子,以及不适宜用“薄膜过滤法”的情况下,可能会因为产品本身的杀菌作用导致细菌无法生长。
当产品不能检测出接种菌种的情况下,应用光谱法确定产品的抑菌/杀菌成分。
缓冲液和培养基(BufferSolutionandMedia)
按照下列配方配制培养基,或者使用规范厂商生产的培养基干粉进行培养基配制,所使用的干粉培养基应该与在此列出的培养基成分比例相似。
在按列出的配方进行培养基配制时,用水溶解固体物质,必要时可以加热以得到完全溶解的均匀溶液。
在使用前用盐酸或氢氧化钠将培养基的pH值调节到要求范围,调节pH值应在25±
2条件下进行。
若培养基配方有琼脂,应使用湿度不超过15%的琼脂。
溶解水为纯化水(PurifiedWater)。
PH7.2磷酸(盐)缓冲液储备液—称34g磷酸二氢钾于1000mL容量瓶,加水500mL溶解。
用氢氧化钠TS调节pH至7.2±
0.1(约175mL),然后加水至容量瓶刻度,混匀。
分装溶液后灭菌。
冰箱保存。
培养基
除另有指出,培养基应在高压灭菌器中加热灭菌。
(见<
1211>
“灭菌”章节中的“蒸汽灭菌”)。
保存时间(exposuretime)取决于培养基的灭菌体积。
1、液体酪蛋白消化物-大豆卵磷脂-聚山梨醇酯20培养基
酪蛋白胰酶消化物------------------20g
大豆卵磷脂---------------------------5g
聚山梨醇酯20-----------------------40mL
水---------------------------------------960mL
将胰腺酪蛋白消化物和大豆卵磷脂溶解于960mL水中,48~50℃水浴加热约30分钟得均匀溶液。
加40mL聚山梨醇酯20,混匀,按需要分装。
2、大豆酪蛋白消化物琼脂培养基
酪蛋白胰酶消化物------------------15.0g
大豆粉木瓜蛋白酶消化物---------5.0g(PapaicDigestofSoybeanMeal)
氯化钠---------------------------------5.0g
琼脂------------------------------------15.0g
水---------------------------------------1000mL灭菌后pH值:
7.3±
0.2
3、液体大豆酪蛋白消化物培养基
按照<
无菌试验里的方法进行配制。
SoybeanCaseinDigestMediumunderSterilityTests<
.
酪蛋白胰酶消化物------------------17.0g
大豆粉木瓜蛋白酶消化物---------3.0g
磷酸氢二钾---------------------------2.5g
葡萄糖(C6H12O6H2O)--------2.5g
纯化水---------------------------------1000mL
4、甘露醇-盐琼脂培养基
酪蛋白胰酶消化物------------------5.0g
动物组织胃蛋白酶消化物---------5.0g
牛肉膏---------------------------------1.0g
D-甘露醇------------------------------10.0g
氯化钠---------------------------------75.0g
酚红------------------------------------0.025g
水---------------------------------------1000mL
混匀,搅拌加热,煮沸1分钟得均匀溶液。
灭菌后pH值:
7.4±
5、Baird-Parker琼脂培养基
酪蛋白胰酶消化物------------------10.0g
牛肉膏---------------------------------5.0g
酵母膏---------------------------------1.0g
氯化锂---------------------------------5.0g
琼脂------------------------------------20.0g
氨基乙酸(糖胶)------------------12.0g
丙酮酸钠------------------------------10.0g
水---------------------------------------950mL
搅拌加热,煮沸1分钟。
灭菌,冷却至45~50℃,然后加入10mL灭菌后的亚碲酸钾(1:
100)和50mL乳状蛋黄。
轻柔混匀,。
。
6、Vogel-Johnson琼脂培养基
酵母膏---------------------------------5.0g
甘露醇---------------------------------10.0g
磷酸氢二钾---------------------------5.0g(DibasicPotassiumPhosphate)
氨基乙酸(糖胶)------------------10.0g
琼脂------------------------------------16.0g
酚红------------------------------------25.0mg
溶解后煮沸1分钟。
灭菌,冷却至45~50℃,然后加20mL灭菌后的亚碲酸钾(1:
100)。
7.2±
7、溴棕三甲铵琼脂培养基
白明胶胰酶消化物------------------20.0g
氯化镁---------------------------------1.4g
硫酸钾---------------------------------10.0g
琼脂------------------------------------13.6g
溴棕三甲铵---------------------------0.3gCetylTrimethylammoniumBromide(Cetrimide)
丙三醇---------------------------------10.0mL
将所有固体溶质加入水中,再加入丙三醇,搅拌加热,煮沸1分钟得均匀溶液。
灭菌后pH值:
8、假单胞菌琼脂培养基检测荧光生二氢荧光素
动物组织胃蛋白酶消化物---------10.0g
无水磷酸氢二钾---------------------1.5g
硫酸镁(MgSO4·
7H2O)-------1.5g
将所有固体溶质加入水中,再加入丙三醇,搅拌加热,煮沸1分钟得均匀溶液。
9、假单胞菌琼脂培养基检测绿脓菌溶素
无水氯化镁---------------------------1.4g
无水硫酸钾---------------------------10.0g
10、液体乳糖培养基
牛肉膏---------------------------------3.0g
白明胶胰酶消化物------------------5.0g
乳糖------------------------------------5.0g
灭菌后需尽快冷却。
6.9±
11、液体亚硒酸-双硫丙氨酸(胱氨酸)培养基
乳糖------------------------------------4.0g
磷酸钠---------------------------------10.0g
亚硒酸钠------------------------------4.0g
L-胱氨酸------------------------------10.0mg
终pH:
7.0±
0.2混匀后加热得均匀溶液。
在流动蒸汽中加热15分钟,不可灭菌。
12、液体连四硫酸盐培养基(四硫磺酸钠亮绿TTB)
酪蛋白胰酶消化物------------------2.5g
动物组织胃蛋白酶消化物---------2.5g
牛胆盐BileSalts---------------------1.0g
碳酸钙---------------------------------10.0g
硫代硫酸钠---------------------------30.0g
煮沸溶液使固体物质溶解。
使用当天加入5g碘化钾和6g碘到20mL水中配制成的溶液,然后加10mL亮绿(1:
1000),混匀。
加入亮绿后的溶液不可加热。
13、亮绿琼脂培养基
酵母膏---------------------------------3.0g
乳糖------------------------------------10.0g
蔗糖------------------------------------10.0g
酚红------------------------------------80mg
亮绿------------------------------------12.5g
水---------------------------------------1000Ml
煮沸溶液1分钟使固体物质溶解。
使用前灭菌,用融化后的培养基倒平皿,冷却凝固后使用。
0.2。
14、戊醛糖-赖氨酸-脱氧胞啶琼脂培养基
戊醛糖---------------------------------3.5g
L-赖氨酸------------------------------5.0g
乳糖------------------------------------7.5g
蔗糖------------------------------------7.5g
氯化纳---------------------------------5.0g
酵母膏---------------------------------3.0g
琼脂------------------------------------13.5g
脱氧胞啶钠---------------------------2.5g(SodiumDesoxycholate)
硫代硫酸钠---------------------------6.8g
柠檬酸铁铵---------------------------800mg
搅拌加热使固体溶解,加热需恰好到沸点,不可过度加热或灭菌。
溶解后立即转移到50℃水浴,在培养基凝固前倒平皿。
15、亚硫酸铋琼脂培养基
葡萄糖---------------------------------5.0g
磷酸钠---------------------------------4.0g
硫酸亚铁------------------------------300mg
亚硫酸铋------------------------------8.0g
亮绿------------------------------------25mg
7.6±
16、三糖-铁-琼脂培养基(TSI)
动物组织胰酶消化物---------------10.0g
葡萄糖---------------------------------1.0g
硫酸铵亚铁---------------------------200mg(FerrousAmmoniumSulfate)
氯化纳----------------------------------5.0g
硫代硫酸钠----------------------------200mg
琼脂-------------------------------------13.0g
酚红-------------------------------------25mg
水----------------------------------------1000mL
灭菌后pH:
17、麦康凯(MacConkey)琼脂培养基
白明胶胰酶消化物------------------17.0g
酪蛋白胰酶消化物------------------1.5g
动物组织胃酶消化物---------------1.5g
牛胆盐混合物------------------------1.5g
中性红---------------------------------30mg
结晶紫---------------------------------1.0mg
7.1±
18、Levine曙红亚甲基蓝琼脂培养基
白明胶胰酶消化物------------------10.0g
磷酸氢二钾---------------------------2.0g
EosinY---------------------------------400mg
亚甲基蓝------------------------------65g
加白明胶胰酶消化物、磷酸氢二钾和琼脂于水,加热溶解后冷却。
使用前融化,按如下量比加入其他液态成分,混匀:
每100mL琼脂溶液加入——5mL乳糖溶液(1:
5)、2mLEosinY溶液(1:
50)、2mL亚甲基蓝溶液(1:
300)。
配制后的溶液应澄清。
19、Sabouraud葡萄糖琼脂培养基
葡萄糖---------------------------------40g
同比配制的动物组织胃酶消化物和酪蛋白胰酶消化物---------------10g
琼脂------------------------------------15g
混合,煮沸得均匀溶液。
5.6±
20、马铃薯葡萄糖琼脂培养基
取300g剥皮的马铃薯,放入500mL蒸馏水中煮溶,过滤,加蒸馏水至1000Ml,然后加入以下物质:
葡萄糖---------------------------------20g
加热溶解后灭菌。
使用前倒平皿。
待培养基冷却到45℃时加入酒石酸溶液(1:
10)调节pH3.5±
0.1,调节pH后不得再加热。
取样(Sampling)每个检测项目需要10mL或10g样品。
操作步骤(Procedure)
准备检测样品,用与样品物理性质相适宜的方法进行样品处理,处理程序不得改变样品最初的微生物数量和种类。
以获得可用于检测操作的溶液或悬液。
对于在一定范围内可溶解但溶解不完全的固体样品,可减少样品量,并加以注明。
然后可采用“好氧微生物总数检查法(TotalAerobicMicrobialCount)”、“金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌检查法(TestforStaphylococcusaureusandPseudomonasaeruginosa)”和“沙门氏菌属和大肠埃希氏菌检查法(TestforSalmonellaSpeciesandEscherichiacoli.)”进行检测。
对于液体样品,溶液或者悬液,或者酒精含量少于30%的水醇溶液,以及易溶且完全溶解于90mLpH7.2的磷酸(盐)缓冲液或已指明的其他溶媒的固体样品,可采用“好氧微生物总数检查法(TotalAerobicMicrobialCount)”、“金