生物制品学2-9章部分重点.docx

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第二章 生物技术与生物制品学的新进展

第一节世界总的特点一、基础研究不断深入

1、新基因的克隆和基因表达调控的研究全面展开；

2、以DNA、RNA和蛋白质为轴心的分子生物学理论和技术两大体系已基本完成。

3、DNA转化和测序也得到应用，开创了生物科学的一个新时代，使生物各学科都进入了分子生物学时代。

4、利用生物技术能有效地研制出对付各种“不治之症”的新药，因而它正吸引和激励着越来越多的科学家进行医药生物技术的基础和应用研究。

5、人类基因组的研究目标，就是要定位所有的基因和测定它们的核苷酸序列。

二、新产品不断出现

1、生物技术药物的品种不断增多，包括基因工程疫苗、细胞因子等。

2、研制了新一代生物技术药物与生物制品，并更新了应用方法。

3、生物技术药物和生物制品的生产方法取得了进展.

4、利用基因工程技术构建新型多价活疫苗，是生物技术的又一个新进展。

三、新技术、新试剂不断出现

1、产生了两种医疗技术：

细胞移植和基因治疗

2、生物试剂的开发。

（1）单抗的主要优点

1）高度同质性：

单抗是由源于一个B淋巴细胞的单克隆杂交瘤细胞系所分泌的，因此抗体分子是同质的，即完全一样的；而多抗是由多种异质抗体分子组成的；2）高度特异性：

单抗是针对一个抗原决定簇的；

3）无限量供应性：

分泌特异单抗的杂交瘤细胞系一旦建立，即可在液氮中长期保存，并可根据需要随时生产理化特性和免疫生物学特性明确的单抗试剂。

同一种单抗不同批次的差异很小，便于标准化。

（2）单抗的交叉反应

特异性强是单抗的特性，但有时单抗可与相关或不相关的抗原发生交叉反应。

因为单抗所识别的是抗原分子上的单个抗原决定簇，其他相关或不相关的抗原分子上有相同或相似的抗原决定簇就可发生交叉反应。

如有些鸡马立克氏病病毒单抗可以与伪狂犬病病毒发生交叉反应。

筛选没有交叉反应的单抗，如在制备新城疫病毒单抗时，首先要去掉与其他副粘病毒发生交叉反应的单抗。

因为新城疫病毒有些抗原决定簇是与其他副粘病毒共有的。

利用交叉反应的特性，如筛选沙门氏菌的属特异单抗。

3、荧光抗体法（fluoresceneAb）、化学发光免疫检测技术（immunitydetection）、DNA探针

（probe）和聚合酶链式反应（PCR）等先进分子生物学检测技术的建立，大提高了诊断方法的敏感性和特异性，促进了诊断试剂的发展。

四、新型生物反应器（Bioreactor）和新分离技术（Newisolation）不断出现各种反应器的应用原则一般是：

1）进行悬浮培养，可用气升式、搅拌式、中空纤维管及陶质矩式通道蜂窝状生物反应器；

2）进行贴壁培养，可用搅拌式（微载体系统）、中空纤维管及陶质矩式通道蜂窝状生物反应器；3）进行包埋培养，可用流化床、固定床生物反应器。

针对各种生物反应器，还开发出了相应的控制装置和技术。

第三章生物制品的制备

原料的选择原则：

①有效成分含量高，新鲜；②原料来源丰富，产地较近；③原料中杂质含量少；④原料成本低等。

原料的选择注意事项：

①植物原料生长的季节性；②微生物原料的对数期；③动物原料的年龄与性别。

原料的预处理与保存：

①动物原料：

采集后要立即处理，去除结缔组织、脂肪组织等，并迅速冷冻贮存。

②植物原料：

要择时采集并就地去除不用的部分，保鲜处理；

③微生物原料：

要及时将菌细胞与培养液分开，进行保鲜处理。

原料的保存方法主要有：

①冷冻法②有机溶剂脱水法③防腐剂保鲜

常用的破碎方法：

①磨切法②压力法③反复冻融法④超声波振荡破碎法⑤自溶法或酶解法提取注意事项：

①选择提取试剂。

②考虑提取溶剂的用量及提取次数、提取时间。

③注意提取的温度、pH、变性剂等因素。

分离纯化技术应满足的要求：

①技术条件要温和，能保持目的产物的生物活性；

②选择性要好，能从复杂的混合物中有效地将目的产物分离出来，达到较高纯化倍数；

③收率要高；

④两个技术之间要能直接衔接，不需要对物料加以处理或调整；

⑤分离纯化过程要快，能够满足高生产率的需求。

分离纯化主要依赖色谱分离方法。

色谱技术是下游精制阶段的常用手段，该法优点是具有多种多样的分离机制，设备简单，便于自动化控制和分离过程中无发热等有害效应。

蛋白质类制品的分离纯化方法：

（1）沉淀法：

原理是使蛋白质胶体颗粒破坏，从而沉淀蛋白质。

常用的有盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、与靶物质结合沉淀法（如抗体—抗原）等。

（2）按分子大小分离的方法：

有超滤法和透折法（即膜分离方法）、凝胶层析法、超速离心法等。

其中膜分离法可用于生物大分子物质的浓缩、分级和脱盐。

（3）按分子所带电荷进行分离的方法：

离子交换柱层析法、电泳法、等电聚焦法等。

（4）亲和层析法

核酸类药物生产方法：

主要有提取法和发酵法。

糖类制品的分离纯化方法：

（1）提取方法：

①非降解法适用于从含一种粘多糖的动物组织中提取粘多糖，提取采用的溶剂是水或盐溶液。

②降解法（degradation）适用于从组织中提取结合比较牢固的粘多糖。

（2）分离方法：

沉淀法和离子交换层析法。

脂类制品的分离纯化方法：

沉淀法、吸附层析法、离子交换层析法

洗脱一般是采用极性逐渐增大的洗脱液来进行，非极性的先流出，极性的后流出。

氨基酸类制品的分离纯化方法

氨基酸的生产方法：

蛋白质水解法（酸水解、碱水解和酶水解）、发酵法

①用盐酸水解为常用方法，其优点是水解迅速、完全，产物全部是L—型氨基酸，缺点是色氨酸全部被破坏，丝氨酸等部分被破坏。

②碱水解法易产生消旋作用，较少应用。

③酶水解法水解不够完全。

氨基酸的分离方法：

有沉淀法、吸附法和离子交换法

人血浆白蛋白制剂的制备

白蛋白又称清蛋白，白蛋白是血浆蛋白中含量最高（3.8～4.8%）、分子量最小、分子数最多的一类蛋白质。

从人体中分离的白蛋白有两种：

一种是从健康人血浆中分离制得的人血清白蛋白，另一种是从健康产妇胎盘中分离制得的胎盘白蛋白。

白蛋白工艺要点：

①络合：

对于络合所要求的pH值，可以略高些，这样，白蛋白络合完全，

络合物形成一个相当硬的块，倾倒上清液方便，损失少。

但不能太高，以防络合血浆中的其它蛋白，影响解离与白蛋白制剂的纯度。

若pH值偏低，络合不完全，络合物松软，甚至成汤状，不利于倾去上清液。

血浆搅拌用NaHCO3调节pH至8.5-8.7之间，缓慢加入与血浆等体积的2.3%利凡诺溶液，边加边搅拌，充分络合后，静置2~4h，分离上清与络合物沉淀。

加入2.3%利凡诺溶液比加入5%利凡诺溶液的效果好？

因为加5%利凡诺溶液常造成灭活时

白蛋白部分变性或者分装困难。

加入2.3%利凡诺溶液的体积一般不超过血浆体积的一半。

这可能是加入利凡诺溶液除去了解离物中过多的Cl-而澄清，或者是加入的利凡诺（过量）使白蛋白与利凡诺的络合物反溶，从而使造成混浊的物质消失，达到澄清的目的。

②解离：

生产中要严格控制溶液的温度。

25℃左右室温，络合物形成一个硬块，利于去上清和解离。

温度太低，虽然不影响络合，但络合物呈稀糊状，倾倒上清液时常会丢失部分络合物，而且络合物内残存较多的利凡诺的水溶液。

解离温度要维持在40℃左右，是解离反应的最适温度。

解离液的pH值在1.28~1.45之间，解离效果良好。

络合物中加入解离液并搅拌均匀后，将解离后混合溶液pH值控制在6.0左右较理想。

以解离后解离混合溶液pH值决定加入解离液的体积。

解离后解离混合液的pH值高于6.5时，表明加入的解离液少了，有部分络合物未被解离开；低于5.85，表明加入的解离液多了，解离过度。

这两种情况下，解离效果均不佳。

在沉淀中加约二分之一血浆体积的灭菌蒸馏水解离所得到的络合物沉淀，将解离混合物溶液用0.5mol/LHCl调节pH至5.5-6.0，加NaCl至0.15%～0.2%，充分搅拌、40℃过夜解离（8-10h）。

在生产过程中常发现，由于解离效果差，从而不能使生产过程顺利进行。

方法：

（1）加入活性炭法：

在解离效果略差，即能够较顺利地离心，得到部分或全部稍混浊的滤液，但不能正常进行压滤时，加入适当的活性炭于滤液中，搅拦均匀后，立即离心，由于活性炭吸附溶液中粘稠物质，形成大颗粒，经离心可以除去杂质，起到澄清的作用。

（2）加入利凡诺法：

在解离时，在由加入的盐酸或（和）盐过多而造成解离物的滤液混浊的情况下，变性前后，向解离物中加入适量的利凡诺溶液均会起到澄清的作用，而回收率却不会降低太多。

变性前加利凡诺溶液比变性后加利凡诺溶液的效果显著。

由于前者在变性过程中反应温度升高了，反应时间增加了。

（3）多次络合法：

如果解离效果极差，用以上两种方法处理都难以达到澄清的目的，那只有采取多次络合法，即在尽量除去解离物中粘稠物质后，将其pH值调至9.0~9.2，加入适量的5%利凡诺溶液，进行重络合，继尔重解离，一般都会得到很理想结果。

如果仍然出现解离不良的现象，重复以上处理过程，直到得到满意的结果。

这种方法使产品纯度高，外观变黄（棕），同时也使成本提高，回收率降低。

③去杂蛋白：

白蛋白具有生物活性，凡是使蛋白质变性的温度都会使白蛋白变性。

65℃条件下变性1h，离心分离出上清液。

④热处理：

在60±0.5℃条件下处理10h，灭活病毒。

⑤检验方法：

冻干品白色疏松物体。

白蛋白含量占95%以上，水分<1%，水溶后pH为6.6-7.2，硫酸铵残量<0.01%，细菌学和热原质检测合格。

尿激酶工艺要点：

①收尿：

男性尿，8h内处理。

调尿液pH6.5以下。

②硅藻土吸附：

加入1%的硅藻土，5℃下搅拌吸附1h。

③洗脱：

硅藻土吸附物用5℃冷水洗涤后装柱，当洗脱液由清变浑时开始收集。

④除热原、色素：

收集液用饱和NaH2PO4，调pH8.0，加NaCl调电导至22M/Ω，过DEAE-SephadexA50层析柱，收集流出活性部分。

⑤CMC浓缩：

流出液用1mol/LHAc调至pH4.2，用蒸馏水调电导至16-17M/Ω，通过CM-C

层析柱。

用10倍体积的pH4.2的HAC-NaAc缓冲液洗涤柱床。

洗后用0.1%氨水0.1mol/L

NaCl溶液洗脱尿激酶。

收集活性组分，杂质被吸附。

⑥产品质量：

无色澄清液或白色冻干粉末。

酶活力>15000IU/mg蛋白质。

绒膜促性激素（HCG）工艺要点：

①吸附粗品：

HCl调孕妇尿至pH4-5，加苯甲酸—乙醇饱和液（孕妇尿：

苯甲酸乙醇饱和液：

乙醇=1:

0.075:

5）搅拌1h静置2-3h，过滤，弃滤液，得吸附物。

在搅拌下加入95%乙醇，至苯甲酸全部溶解有絮状沉淀产生，静置过夜，离心，沉淀用95%乙醇和丙酮洗涤，干燥得粗制品。

②提取：

加10倍量的4℃1/15 mol/L、pH4.8醋酸盐缓冲液，搅拌4h，离心，取上清液。

沉淀再提取2h。

合并两次提取液，弃去沉淀。

③离子交换层析：

CM-Sepharose柱用0.01mol/L的醋酸盐缓冲液平衡后样品上柱。

依次用

pH4.8、0.01mol/L的醋酸盐缓冲液和pH5.9、0.01mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤出两个峰（杂质）

。

再用pH8.5、0.2mol/L的醋酸盐缓冲液洗脱，得到的第3峰即为HCG。

④羟基磷灰石柱层析：

柱用pH6.8、0.5mmol/L磷酸盐缓冲液平衡。

样品用

pH6.8、0.5mmol/L的磷酸盐缓冲液进行层析上柱。

洗脱先用pH6.8、0.5mmol/L再用pH6.8

1.0mmol/L的磷酸盐缓冲液。

得