两种细胞系用于建立体外脂肪肝模型的比较.docx

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两种细胞系用于建立体外脂肪肝模型的比较

两种细胞系用于建立体外脂肪肝模型的比较

【摘要】　目的对比油酸诱导肝癌细胞株HepG2、正常肝细胞株L02建立的肝细胞脂肪变性模型,通过检验复方蛋氨酸胆碱的防治作用，寻找简便、稳定的体外药物筛选模型。

方法设正常组、HepG2模型组、HepG2不同浓度给药组、L02模型组、L02不同浓度给药组、用油酸诱导肝细胞脂肪变,复方蛋氨酸胆碱干预，以油红O染色镜下观察细胞内脂滴形成状况,并检测细胞上清中的ALT、AST、γGT水平。

结果油酸刺激HepG2、L02肝细胞24h,细胞内典型脂肪滴形成。

复方蛋氨酸胆碱2次给药，药物难以使HepG2细胞内脂滴减少，L02细胞在加油酸48h后油红O染色证明细胞内脂滴可减少，脂滴表达的红色IOD值，各给药组与模型组比较，差异有极显着性（）。

细胞上清液中ALT、AST、γGT，复方蛋氨酸胆碱各组与模型组比较差异有显着性，证实其对肝细胞损伤较小。

结论L02比HepG2更适合作为体外的筛药细胞模型，油酸刺激L02细胞形成脂肪变，药物提前24h干预，24h后再给药1次，这种造模和给药方案可作为一种可行的脂肪肝细胞筛药模型使用。

【关键词】　肝癌细胞株HepG2;L02肝细胞株;油酸;脂肪肝;模型;体外;复方蛋氨酸胆碱

Abstract:

ObjectiveTocomparetwomodelsofhepatocyticsteatosisinvitro，whichwereestablishedbytreatinghepatocarcinomacellHepG2andhumanlivercellL02witholcacidinvitro.Throughexaminationtheroleofcompoundmethionineandcholinebitartrate,tofindaconvenientandstablemodelinvitrofordrug　Normalgroup,HepG2modelgroup,groupsofHepG2cellstreatedwithcompoundmethionineandcholinebitartrateatdifferentconcentrations,L02modelgroup,andmodelgroupsofL02cellstreatedwithdrugatdifferentconcentratrionsweresetup.ThehepatocyticsteatosismodelswereestablishedbytreatingHepG2andL02witholcacidinvitro.ThefattydropletsincellscouldbeobservedbyoilredOstainingunderlightmicroscope.ALT,AST,andγGTincellsupernatantweredetectedbyreactant　Aftertreatedwitholeicacidfor24hours,thefattydropletsincellswereobservedbyoilredOstainingunderlightmicroscope.Withthepreventionwithcompoundmethionineandcholinebitartrate,theamountoflipiddropletinHepG2cellsdidnotdecrease,butdecreasedinL02cellsaftertreatedwitholeicacidfor48hours.Comparedwiththemodelgroup,theintegralopticaldensity（IOD）valueofpositiveofredfattydropletsinthegrouptreatedwithdrugsdecreasedmarkedly（）.ThereweresignificantdifferencesinALT,AST,andγGTincellsupernatantinthegroupstreatedwithcompoundmethionineandcholinebitartrateandmodelgroups,indicatingthatthedamagetohepatocyteL02was　L02celllinewasmoresuitableinthedevelopingofinvitromodelofhepatocyticsteatosis,themodelwitholeicoilinducedsteatosis,intervenedwithcompoundmethionineandcholinebitartratefor24hours,andtreatedwitholeicacid24hourslater,themethodcouldbeusedtodevelopaninvitromodelofhepatocyticsteatosismodelfordrugscreen.

　　Keywords:

hepatocarcinomacellHepG2;humanlivercellL02;oleicacid;fattyliver;model;invitro;compoundmethionineandcholinebitartrate

　　近年来,非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的发病率不断上升,由于它是肝硬化、肝癌的重要病因[1,2],已成为肝病领域的新挑战。

目前对脂肪肝的研究主要采用的是动物模型，存在个体差异较大、实验条件不好控制、周期较长、材料耗费较多等缺点。

而细胞模型实验却可以很好地克服上述缺点，不仅能针对性地探究细胞水平的脂肪肝发病机制，并且能有效地缩短筛选治疗药物的进程，有助于筛选大量的药物。

　　由于脂肪肝筛药细胞模型报道较少，本研究拟采用油酸作用于在体外培养的肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞（L02细胞株）的方式，建立脂肪肝的体外模型，结合油红O染色观察细胞内脂肪滴变化情况，来验证该肝细胞是否产生脂肪变性，并观察复方蛋氨酸胆碱的防治作用，以期寻找简便、稳定的体外药物筛选模型。

　　1材料与方法

　　材料

　　细胞株

　　人正常肝细胞（L02株）由中科院上海细胞研究所提供;人肝癌细胞株HepG2由福建医科大学药理研究所提供。

　　药物

　　复方蛋氨酸胆碱片（主要成分：

蛋氨酸g、重酒石酸胆碱g、维生素B12mg、维生素B22mg、维生素B62mg、泛酸钙3mg、烟酰胺6mg等），中国通化东宝药业股份有限公司。

　　主要试剂和设备

　　油酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司;RPMI1640培养基，美国GIBCO公司;胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司;小牛血清，美国GIBCO公司;胰蛋白酶，美国Hyclone公司;四甲基偶氮唑盐（MTT）,上海华舜生物工程公司;油红O，国药集团化学试剂有限公司;丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒、γ谷氨酰转肽酶（γGT）试剂盒均购自中生北控生物科技股份有限公司。

　　A/B31285型超净台，美国Forma公司;371型直热式二氧化碳培养箱，美国Forma公司;550型酶标仪，美国BioRad公司;SD811L半自动生化仪，上海迅达医疗仪器厂。

　　方法

　　细胞培养方法用6孔板将人肝癌细胞株HepG2、人正常肝细胞株L02接种于含5%胎牛血清（FBS）、5%小牛血清的RPMI1640培养液中，细胞培养同时放入盖玻片，使细胞贴壁于玻片上生长。

置37℃、5%CO2饱和湿度孵育箱内培养。

根据细胞生长情况，每2～3天用%的胰蛋白酶消化，进行传代培养。

　　MTT实验筛选DMSO、复方蛋氨酸胆碱作用浓度将HepG2、L02细胞培养于96孔板中,实验分别设空白对照组、复方蛋氨酸胆碱（DMSO溶解）、DMSO各3个实验组，每组均设3个平行孔。

分别加入含不同浓度的DMSO（表1）、复方蛋氨酸胆碱（表2）,用MTT比色法测定细胞增殖情况（以吸光度A值表示）,了解药物对细胞增殖的影响情况，实验重复3次。

　　抑制率IR（%）=（1-实验组平均A值/空白对照组平均A值）×100%

　　脂肪肝细胞模型的建立接种HepG2、L02细胞24h，待细胞贴壁生长后，设对照组、模型组。

对照组：

用RPMI1640（含5%胎牛血清，5%小牛血清）培养液培养;模型组：

分别用含20、40、60、80、100、120μg·mL-1的油酸及培养液培养;每组均设3个平行孔。

培养3d，用油红O染色镜下观察细胞浆内变化。

选择油酸作用最佳浓度，实验重复3次。

　　分组给药将HepG2、L02细胞各分5组,对照组（用正常培养基）、模型组（油酸以DMSO溶解，浓度由预实验确定）、给药组（复方蛋氨酸胆碱片以DMSO溶解，200μg·mL-1组、300μg·mL-1组、400μg·mL-1组，细胞培养24h后给药1次，48h后换液再给药1次），细胞培养48h后各组（除正常组外），加入油酸造模。

每组各3孔，观察48h，实验重复3次。

　　细胞内脂滴形成的观察将玻片从6孔板中取出，PBS液洗5min×3次,4%多聚甲醛固定20min。

PBS液洗细胞2次，60%异丙醇漂洗数秒。

室温下油红O染色10～15min，蒸馏水终止染色，细胞内的中性脂肪可被染成桔红色或红色。

显微镜下观察各组细胞内脂滴形成情况。

　　ALT、AST、γGT的测定细胞种植于6孔培养板内,每孔为1个样本,每组设3个样本,培养72h后分别收集上清液。

测定ALT、AST、γGT。

　　染色分析ImagePro　像分析分析油红O染色图片，每组随机选取3个具有代表性的高倍视野，计算脂滴表达的红色IOD（积分光密度）值，并进行比较。

　　数据处理分析用SPSS13.0软件，数据以x±s表示,计量资料组间比较用t检验,为差异有显着性。

　　2结果

　　DMSO、复方蛋氨酸胆碱对HepG2、L02细胞增殖的影响

　　DMSO体积分数≤0.4%时对作用了48h的HepG2、L02细胞增殖无明显影响（表1），可作为溶剂使用。

复方蛋氨酸胆碱200、300、400μg·mL-1组作用于HepG2、L0248h后对细胞的生长无明显影响（表2）。

表1不同浓度的DMSO对HepG2、L02细胞生长的影响

　　油酸作用浓度的确定

　　HepG2细胞组，油酸刺激24h后，20、40μg·mL-1胞浆内有少量被染成桔红色或红色的颗粒状脂滴，分布在靠近细胞膜的区域，使整个细胞的形态表2不同浓度的复方蛋氨酸胆碱对HepG2、L02细胞生长的影响

　　呈现出“印戒”状，随着浓度的递增，细胞内的红色脂滴数量逐渐增多。

80μg·mL-1细胞内的红色脂滴较明显，120μg·mL-1存在活细胞数减少明显，且在光镜下观察发现细胞边缘不清晰，细胞内颗粒较多，细胞大量浮起和坏死。

48h后各组细胞内的红色脂滴开始减少。

故选择80μ