高中生物选修一学案22 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数.docx

高中生物选修一学案22 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数.docx

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高中生物选修一学案22土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

[目标导航]　1.能利用选择培养基分离细菌。

2.能运用稀释涂布平板法测定土壤中分解尿素细菌的数量。

一、研究思路

1．课题背景

尿素是一种重要的农业氮肥，但农作物不能（能、不能）直接吸收利用，而是首先通过土壤中的细菌将尿素在脲酶的催化下分解为氨之后，才能被植物吸收。

2．筛选菌株

微生物筛选的原理：

人为提供有利于目的菌株生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物生长，如可从热泉中将Taq细菌筛选出来。

3．统计菌落数目

（1）测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数法。

（2）稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目

①为了保证结果准确，一般设置多于3个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取平均数。

②统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。

4．设置对照

设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

二、实验设计

1．操作步骤：

土壤取样→样品的稀释→微生物的培养与观察。

2．土壤取样一般要铲去表层土，因为绝大多数细菌分布于距地表约3～8__cm的土壤层。

3．样品的稀释：

不同的微生物需要稀释的倍数不同，请填写下表：

微生物

稀释倍数

细菌

104、105、106

放线菌

103、104、105

真菌

102、103、104

4.微生物的培养与观察

微生物的生长受温度的影响，菌落的数目和特征是观察的主要内容。

三、操作提示

1．无菌操作：

取土样用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都需要灭菌。

称取土样要在火焰旁进行。

稀释样品要在火焰旁操作。

2．做好标记：

要对平板和试管进行标记，尤其进行系列稀释时要按稀释度递增顺序将试管排列成行。

四、课题延伸

分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，使培养基的碱性增强。

在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可以初步鉴定该种细菌能够分解尿素。

判断正误：

（1）选择培养基只允许特定的微生物生长，而抑制或阻止其他微生物的生长（　　）

（2）对活菌进行计数时，所做的平板越大越好（　　）

（3）设置对照实验可以排除一些非测试因素对实验结果的影响（　　）

（4）从土壤中取样时，土层越浅越好（　　）

（5）来自土壤的微生物稀释倍数越大越好（　　）

[答案]　

（1）√　

（2）×　（3）√　（4）×　（5）×

一、选择培养基相关问题分析

1．概念：

在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。

2．原理：

根据不同微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性不同而制备培养基。

例如：

用培养基选择能分解尿素的微生物的原理

培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。

缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源，而不能生长、繁殖，所以用此培养基就能够选择出能分解尿素的微生物。

3．方法

（1）在培养基中加入某种化学物质。

例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。

这里的“加入”是在培养成分的基础上加入。

（2）改变培养基中的营养成分。

例如，缺乏氮源时可以分离固氮微生物；石油作为唯一碳源时，可以分离出能消除石油污染的微生物。

（3）改变微生物的培养条件。

例如，将培养基放在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物。

1．伊红美蓝培养基为什么不是选择培养基？

[答案]　伊红美蓝只能显示有无大肠杆菌，不能实现只允许一种微生物生存而抑制或影响其他微生物的生存，所以伊红美蓝培养基不是选择培养基。

2．一种自养微生物与多种异养微生物混合在一起，如何将自养微生物选择出来？

[答案]　用不含有机碳源的培养基进行培养，因为自养微生物可以利用空气中的CO2而异养微生物不可以，所以能在培养基中生存的就是自养微生物。

3．2013年11月22日凌晨3点，青岛黄岛区发生石油泄漏事件，一些微生物可以有效地分解石油，如何配制选择培养基将这类微生物选择出来？

[答案]　配制的选择培养基中，石油作为唯一的碳源，然后用这种培养基培养多种微生物，凡是能在该种培养基上生存的就是能分解石油的微生物。

1．苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。

某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如图所示，①为土壤样品。

请回答下列问题。

（1）②中培养目的菌株的选择培养基中应加入________作为唯一碳源，②中不同浓度碳源的培养基__________（填“影响”或“不影响”）细菌的数量，如果要测定②中活细菌数量，常采用______________法。

（2）④为对照，微生物在④中不生长，在⑤中生长，④与⑤培养基的主要区别在于______________________________________________________________________

_____________________________________________________________________；

使用__________________________________法可以在⑥上获得单菌落。

采用固体平板培养细菌时进行倒置培养的原因是____________________________________

_____________________________________________________________________。

（3）实验过程中如何防止其他微生物的污染？

______________________________________________________________________

_____________________________________________________________________。

[问题导析]　

（1）题目中的目的菌株是降解苯酚的细菌，选择培养基与完全培养基相比最大的差别是碳源不同，选择培养基中苯酚是唯一的碳源。

（2）苯酚的浓度会对能分解苯酚的细菌产生影响。

能否生存取决于细菌能否利用苯酚，细菌的分解能力可以通过改变苯酚的浓度判断出来。

[答案]　

（1）苯酚　影响　稀释涂布平板　

（2）④的培养基没有加入苯酚作为碳源，

⑤的培养基加入苯酚作为碳源　稀释涂布平板法或平板划线　以防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基　（3）培养基灭菌，接种环境灭菌，接种过程无菌操作

[解析]　根据微生物对营养的需求，在培养基中加入或不加某些物质以达到促进目的菌生长，抑制或阻止其他杂菌生长的目的，然后再用稀释涂布平板法、平板划线法或其他方法筛选出单个目的菌落，再接种培养即可获得纯目的菌。

为防止培养基中水分蒸发形成的水珠落入培养基中影响菌体生长，所以要将培养皿倒置。

在设计实验中要注意单一变量原则和对照原则，操作中要严格进行无菌操作。

[一题多变]

（1）为什么测定活菌的数量不能用平板划线法？

[答案]　由于在所划的线中，只有最后一次划线的末端才会形成由一个细菌形成的菌落，而其他一些菌落往往由两个细菌或多个细菌繁殖而成，而在计数时一个菌落对应着一个细菌，这样在划线所得的平板中，菌落数目低于活菌的实际数值，所以不能用平板划线法测定活菌数量。

（2）如何判断培养基是否被污染？

[答案]　在不接种微生物的情况下将培养基在培养箱中进行培养，如果培养基中无菌落出现，则说明没有被污染，如果有菌落出现，则说明培养基被污染。

（3）两位同学在取土壤样品时，一位同学在不含苯酚的土壤中取样，另一位同学在含苯酚的土壤中取样，哪位同学做法较好？

[答案]　在含有苯酚的土壤中取样较好。

二、统计菌落的数目

1．显微镜直接计数法（总菌计数法）

（1）原理：

此法利用特定细菌计数板或血球计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。

（2）方法：

用计数板计数。

计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积为1mm2和高为0.1mm的计数室，在1mm2的面积里又被划分成25个（或16个）中格，每个中格进一步划分成16个（或25个）小格，但计数室都是由400个小格组成的，如图所示。

（3）计算公式：

每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数

（4）缺点：

不能区分细菌的死活。

2．间接计数法（活菌计数法）

（1）原理：

当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。

通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。

（2）计算公式：

每克样品中的菌株数＝（C÷V）×M。

其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用稀释液的体积（mL），M代表稀释倍数。

（3）统计方法：

统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板上菌落数的平均值，然后按公式进行计算。

2．自然界中的微生物往往是混杂生长的。

人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。

下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题。

步骤如下：

①制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。

②为了得到更加准确的结果，应选用__________法接种样品。

③适宜温度下培养。

结果分析：

（1）测定大肠杆菌数时，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，与事实更加接近的是__________。

A．一个平板，统计的菌落数是230

B．两个平板，统计的菌落数是220和260，取平均值240

C．三个平板，统计的菌落数分别是400、212和256，取平均值289

D．四个平板，统计的菌落数分别是210、260、240和250，取平均值240

（2）一同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上菌落数的平均值为212，那么每毫升样品中的菌落数约是（涂布平板时所用的稀释液体积为0.2mL）__________。

（3）用这种方法测定菌体密度时，实际活菌数量要比测得的数量__________（多/少），因为_____________________________________________________________

_____________________________________________________________________。

[问题导析]　

（1）因为题中操作的目的需要对大肠杆菌进行数量的测定，所以接种的方法是稀释涂布平板法。

（2）测定活菌数量时，选择的平板越多误差越小，且选择的平板要能形成30～300个菌落。

（3）所做的多个平板中，如果其中一个平板中菌落的数目

明显多于或少于其他几个平板，则说明该平板不符合要求，应重做或舍弃。

[答案]　步骤②：

稀释涂布平板　

（1）D　

（2）1.06×109个

（3）多　当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落

[解析]　若对大肠杆菌进行计数，则需要用稀释涂布平板法接种样品。

（1）应选取多个菌落数相差不大的平板进行计数，取其平均值。

（2）212÷0.2×106＝1.06×109（个）。

（3）因为一个菌落可能由两个或多个细菌连在一起生长而成，所以实际活菌数量要比测得的数量多。

[一题多变]

（1）如果某同学的稀释倍数仅为104，则测定的数值要比题中操作的数值高还是低？

为什么？

[答案]　低，因为稀释倍数太低，则大部分菌落是多个细菌繁殖而成，所以观察到的菌落的数值要低于由单一细菌形成的菌落数值。

（2）第

（1）小题C项中菌落数为400的平板不符合要求，试分析该平板中菌落数