生物催化技术知识点总结Word格式.docx
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3、当前生物催化研究热点
新酶或已有酶新功能开发
依照已有底物开发新酶反映
运用突变或定向进化技术改进生物催化剂性能
运用重组DNA技术大规模生产生物催化剂
运用有机溶剂或共溶剂开发新反映体系
体内或体外合成多酶体系
克服底物和产物抑制
精细化工品或医药合成技术放大
辅因子再生
生物催化剂修饰
生物催化剂固定化
4、酶工程就是将酶或者微生物，动植物细胞，细胞器等在一定生物反映装置中，运用酶所具备生物催化功能,借助工程手段将相应原料转化成有用物质并应用于社会生活一门科学技术。
世界三大酶制剂公司
诺维信（Novo）（丹麦）
杰能科（GenencorInternational）（美国）
DSM（荷兰）
5、酶是生物细胞产生、具备催化能力生物催化剂。
6、酶特性
只能进行热力学上容许进行反映
可以缩短化学反映到达平衡时间而，不变化反映平衡点
通过减少活化能加快化学反映速度
7、酶分类命名
氧化还原酶Oxidoreductase
转移酶Transferase
水解酶hydrolase
裂合酶Lyase
异构酶Isomerase
合成酶LigaseorSynthetase
8、国际命名法：
乳酸脱氢酶EC1.1.1.27（第一大类，第一亚类，第一亚亚类，亚亚类流水编号）
酶发现及研究历史J.B.Sumner从刀豆制备出脲酶结晶
1982年T.Cech发现了第1个有催化活性天然RNA——ribozyme（核酶）
9、酶构成单纯酶
结合酶=酶蛋白+辅因子（辅基、辅酶、金属激活剂）
核酸类酶（R酶）分类剪切酶，剪接酶和多功能酶
10、必须基团：
这些基团若经化学修饰使其变化，则酶活性丧失。
活性部位：
酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接关于部位。
11、酶专一性立体异构专一性相对专一性（基团/族）+绝对专一性（特底）
构造专一性
12、影响酶催化因素：
温度、PH、底物浓度、酶浓度、抑制剂、激活剂（氯淀）
13、竞争性抑制：
指抑制剂和底物竞争与酶分子结合而引起抑制作用。
机制：
竞争性抑制剂与酶作用底物构造相似。
它与酶分子结合后来，底物分子就不能与酶分子结合，从而对酶催化起到抑制作用。
例如，丙二酸是琥珀酸构造类似物。
丙二酸是琥珀酸脱氢酶竞争性抑制剂。
非竞争性抑制（noncompetitiveinhibition）：
指抑制剂与底物分别与酶分子上不同位点结合，而引起酶活性减少抑制作用。
由于非竞争性抑制剂是与酶活性中心以外位点结合，因此，抑制剂分子构造也许与底物分子构造毫不有关。
增长底物浓度也不能使非竞争性抑制作用逆转。
反竞争性抑制（uncompetitiveinhibition）：
在底物与酶分子结合生成中间复合物后，抑制剂再与中间复合物结合而引起抑制作用。
反竞争性抑制剂不能与未结合底物酶分子结合，只有当底物与酶分子结合后来由于底物结合引起酶分子构造某些变化，使抑制剂结合部位呈现出来，抑制剂才干结合并产生抑制作用。
因此亦不能通过增长底物浓度使反竞争抑制作用逆转。
14、酶活力：
在特定条件下（温度可采用25℃或其他选用温度，pH等条件均采用最适条件），每1min催化1μmol底物转化为产物酶量定义为1个酶活力单位
15、酶与底物结合模型：
锁钥学说、诱导契合学说
第二章微生物发酵产酶
16、酶生物合成过程
提取分离
生物合成：
酶生物合成重要是指细胞内RNA和蛋白质合成过程.
化学合成
17、优良产酶微生物具备条件：
（1）酶产量高；
（2）产酶稳定性好；
（3）容易培养和管理；
（4）利于酶分离纯化；
（5）安全可靠、无毒性等。
18、酶发酵方式
固体培养发酵
液体深层发酵
固定化微生物细胞发酵
固定化微生物原生质体发酵
19、常用产酶微生物
细菌：
肽聚糖、二分裂，原核；
球、杆、螺旋；
G+:
磷壁酸、L-赖氨酸、紫G-：
脂多糖、二氨基庚二酸、红
放线菌：
原核；
菌丝状生长，孢子繁殖；
G+
酵母菌：
甘露聚糖、葡聚糖；
出芽繁殖；
糖酸；
真核
霉菌：
基本单位是菌丝；
真核；
孢子繁殖
酶生物合成过程ThebiosynthesisprocessofEnzyme
中心法则
RNA生物合成
蛋白质生物合成
酶生物合成调节雅各（Jacob）和莫诺德（Monod）于1960年提出操纵子学说（Operontheory）来阐明。
常用产酶微生物基本规定
不是致病菌
发酵周期短,产酶量高
不易变异退化
最佳是产生胞外酶菌种,利于分离。
对医药和食品用酶,还应考虑安全性：
凡从可食某些或食品加工中老式使用微生物生产酶,安全!
由非致病微生物制取酶,需作短期毒性实验。
非常用微生物制取酶,需做广泛毒性实验,涉及慢性中毒实验。
酶发酵工艺条件及控制
20、培养基（medium）是人工配制，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物营养基质。
21、常用碳源：
糖类、醇类、脂类、有机酸、烃类、蛋白质及其降解物
氮源：
蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、铵盐、硝酸盐
无机盐
参加酶构成、构成酶活性基、激活酶活性
维持细胞构造稳定性
调节细胞渗入压
控制细胞氧化还原电位
有时可作某些微生物生长能源物质
生长因子是指某些微生物不能用普通碳源、氮源物质进行合成，而必要此外加入少量生长需求有机物质。
化学构造提成维生素、氨基酸、嘌呤（或嘧啶）及其衍生物和类脂成分等四类。
功能：
以辅酶与辅基形式参加代谢中酶促反映
22、培养基设计原则
1、选取适当营养物质
2、营养物浓度及配比适当
3、物理、化学条件适当
4、经济节约
5、精心设计、实验比较
23、实验室惯用培养基：
牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）；
高氏1号合成培养基培养；
麦芽汁培养基；
查氏合成培养基；
例如枯草芽孢杆菌：
普通培养：
肉汤培养基或LB培养基；
自然转化：
基本培养基；
观测芽孢：
生孢子培养基；
产蛋白酶：
以玉米粉、黄豆饼粉为主产酶培养基；
发酵条件及控制
pH值调节控制
温度调节控制
溶解氧调节控制调节通气量调节氧分压变化培养液性质调节气液接触时间调节气液接触面积
24、提高酶产量办法
添加诱导物。
酶作用底物：
乳糖诱导大肠杆菌β-半乳糖苷酶。
L-苯丙氨酸诱导苯丙氨酸解氨酶合成等。
酶催化反映产物：
半乳糖醛酸是果胶酶催化果胶水解产物，它可以作为诱导物，诱导果胶酶生物合成；
纤维二糖诱导纤维素酶生物合成；
没食子酸诱导单宁酶产生等。
作用底物类似物：
异丙基-β-硫代半乳糖苷（IPTG）对β-半乳糖苷酶诱导效果比乳糖高几百倍
控制阻遏物浓度。
产物阻遏和分解代谢物阻遏
添加表面活性剂。
将适量非离子型表面活性剂，如吐温（Tween）、曲通（Triton）等添加到培养基中，可以加速胞外酶分泌，而使酶产量增长。
由于离子型表面活性剂对细胞有毒害作用，特别是季胺型表面活性剂（如‘新洁而灭’等）是消毒剂，对细胞毒性较大，不能在酶发酵生产中添加到培养基中。
添加产酶增进剂。
添加一定量植酸钙镁，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶产量提高1～20倍,添加聚乙烯醇（Polyvinylalcohol）可以提高糖化酶产量。
25、细胞生长四个时期：
调节期、生长期、平衡期、衰退期。
通过度析比较细胞生长与酶产生关系，可以把酶生物合成模式分为4种类型。
即同步合成型（米曲霉在具有单宁或者没食子酸培养基中生长，在单宁或没食子酸诱导作用下，合成单宁酶（tanaseEC3.1.1.20）），延续合成型（在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果胶为单一碳源培养基中培养，可以诱导聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，EC3.2.1.15）生物合成。
），中期合成型（枯草杆菌碱性磷酸酶（Alkalinephophatase，EC3.1.3.1）生物合成模式属于中期合成型。
）和滞后合成型（受到培养基中存在阻遏物阻遏作用。
只有随着细胞生长，阻遏物几乎被细胞用完而使阻遏解除后，酶才开始大量合成。
）。
最抱负合成模式应是延续合成型。
由于属于延续合成型酶，在发酵过程中没有生长期和产酶期明显差别。
细胞一开始生长就有酶产生，直至细胞生长进入平衡期后来，酶还可以继续合成一段较长时间。
26、monod方程：
在培养过程中，细胞生长速率与细胞浓度成正比
27、细胞破碎（胞内酶）
1）机械破碎
2）物理破碎
4）酶解破碎
28、层析分离是运用混合液中各组分物理化学性质（分子大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力、分派系数等）不同，使各组分以不同比例分布在两相中。
层析办法分离根据
吸附层析运用吸附剂对不同物质吸附力不同而使混合物中各组分分离（解吸、吸附、再解吸、再吸附）
分派层析运用各组分在两相中分派系数不同，而使各组分分离
离子互换层析运用离子互换剂上可解离基团（活性基团）对各种离子亲和力不同而达到分离目。
在溶液pH值不不大于酶等电点时，酶分子带负电荷，可用阴离子互换剂进行层析分离；
当溶液pH值不大于酶等电点时，酶分子带正电荷，则要采用阳离子互换剂进行分离。
（装柱、上柱、洗脱和收集、再生）
凝胶层析以各种多孔凝胶为固定相，运用流动相中所含各种组分相对分子质量不同而达到物质分离（装柱、上柱、洗脱等过程）
亲和层析运用生物分子与配基之间所具备专一而又可逆亲和力，使生物分子分离纯化
层析聚焦将酶等两性物质等电点特性与离子互换层析特性结合在一起，实现组分分离
29、萃取分离是运用物质在两相中溶解度不同而使其分离技术。
萃取分离中两相普通为互不相溶两个液相。
按照两相构成不同，萃取可以分为有机溶剂萃取、双水相萃取、超临界萃取和反胶束萃取等。
超临界萃取又称为超临界流体萃取，是运用欲分离物质与杂质在超临界流体中溶解度不同而达到分离一种萃取技术。
超临界流体（supercriticalfluid，SF）是一种物质状态，当物质在超过临界温度及临界压力以上，气体与液体性质会趋近于类似，最后会达到一种均匀相流体现象。
超临界流体类似气体具备可压缩性，并且又兼具备类似液体流动性，密度普通都介于0.1到1.0g/ml之间。
30、依照物质颗粒或分子通过薄膜原理和推动力不同，膜分离可以分为3大类。
（1）加压膜分离:
以薄膜两边流体静压差为推动力膜分离技术。
在静压差作用下，不大于孔径物质颗粒穿过膜孔，而不不大于孔径颗粒被截留。
◇依照所截留物质颗粒大小不同，加压膜分离可分为微滤、超滤和反渗入等3种。
（2）电场膜分离
◆电场膜分离是在半透膜两侧分别装上正、负电极。
在电场作用下，小分子带电物质或离子向着与其自身所带电荷相反电极移动，透过半透膜，而达到分离目。
◆电渗析和离子互换膜电渗析即属于此类。
（3）扩散膜分离
◆扩散膜分离是运用小分子物质扩散作用，不断透过半透膜扩散到膜外。
而大分子被截留，从而达到分离效果。
常用透析就是属于扩散膜分离。
◆透析膜可用动物膜、羊皮纸、火棉胶或赛璐玢等制成。
◆透析重要用于酶等生物大分子分离纯化，从中除去无机盐等小分子物质。
膜产品普通采用如下几种构造形式：
管式；
中空纤维；
卷式；
平板式。
31、洗脱剂选取要注意下列各点：
◇洗脱剂不会与吸附剂起化学反映，也不会使吸附剂溶解。
◇洗脱剂对混合液中各组分溶解度大，粘度小，流动性好，容易与被洗脱组分分离。
◇洗脱剂规定一定纯度，以免杂质对分离带来不利影响。
32、固定化酶定义：
通过物理或化学手段，将酶束缚于水不溶载体上，或将酶柬缚在一定空间内，限制酶分子自由流动，但能使酶充分发挥催化作用；
过去曾称其为水不溶酶或固相酶。
固定化酶长处
（1）易将固定化酶与底物、产物分开；
产物溶液中没有酶残留，简化了提纯工艺。
（2）可以在较长时间内重复使用，有利工艺持续化、管道化。
（3）酶反映过程可以严格控制，有助于工艺自动化和微电脑化。
（4）在绝大多数状况下提高酶稳定性。
（5）较能适应于多酶反映。
（6）酶使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保障，成本低。
固定化酶缺陷
（1）酶固定化时酶活力有所损失。
同步也增长了固定化成本。
（2）比较适应水溶性底物和小分子底物。
（3）与完整细胞比较，不适于多酶反映．
33、固定化酶制备办法：
吸附法（pH，离子强度，蛋白质浓度，温度，吸附速度，载体）、包埋法（对底物和产物是大分子酶并不适合）、共价结合法（偶联）交联法
固定化办法与载体选取
1.必要注意维持酶催化活性和专一性
2.酶与载体结合牢固
3.载体机械强度
4.固定化酶要有最小空间位阻
5.载体稳定，不可与底物、产物发生反映
6.固定化酶要便宜
34、无载体固定化酶新技术
长处：
在载体固定化酶中，由于聚合物载体存在而大大减少了酶与大分子底物结合容量和反映能力，而无载体固定化酶具备较高催化剂比表面；
较高酶催化活性，成本低；
受底物扩散限制影响较小；
可提高了酶在极端条件下及有机溶剂中和蛋白酶中操作稳定性等长处。
35、固定化细胞
将细胞限制或定位于特定空间位置办法称为细胞固定化技术。
被限制或定位于特定空间位置细胞称为固定化细胞。
（固定化活细胞或固定化增殖细胞）
微生物细胞、植物细胞和动物细胞都可以制成固定化细胞。
固定化细胞特点有细胞特性，生物催化剂功能，固相催化剂特点。
不必进行酶分离纯化
保持酶原始状态，酶回收率高
比固定化酶稳定性高
细胞内酶附助因子可再生
抗污染能力强
36、细胞自身通过各种办法使酶分子构造发生某些变化，从而变化酶某些特性和功能技术过程称为酶分子修饰。
即：
在体外将酶分子通过人工办法与某些化学基团（物质），特别是具备生物相容性物质，进行共价连接，从而变化酶构造和性质。
含多酶体系
37、酶分子修饰原理
1、修饰剂分子存在各种反映基团，可与酶形成多点交联。
使酶天然构象产生“刚性”构造。
从而增强酶天然构象稳定性与耐热性。
2、大分子修饰剂与酶结合后，产生空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶活性部位。
从而保护酶活性部位并起到低抗抑制剂和抗蛋白水解酶作用。
3、酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏也许性。
4、酶蛋白氨基酸构成抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。
破坏了抗原决定簇—抗原性减少乃至消除，“遮盖”了抗原决定簇—阻碍抗原、抗体结合。
消除酶抗原性，使酶稳定。
5、大分子修饰剂自身是多聚电荷体，能在酶分子表面形成“缓冲外壳”，抵抗外界环境极性变化，维持酶活性部位微环境相对稳定。
修饰剂选取原则
1.修饰剂分子量及链长度（规定有较大分子量）。
2.修饰剂上反映基团数目及位置（规定有较多反映活性基团）。
3.修饰剂上反映基团活化办法与条件（规定有完善办法）
酶分子修饰基本规定和条件：
对酶分子进行修饰必要在修饰原理、修饰剂和反映条件选取以及酶学性质等方面都要有足够理解。
修饰反映尽量在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏酶活性功能必须基团，使修饰率高，同步酶活力回收高。
38、大分子修饰（大分子结合修饰）：
运用水溶性大分子与酶结合，使酶空间构造发生某些精细变化，从而变化酶特性与功能办法。
非共价修饰+共价修饰
小分子修饰（酶蛋白侧链基团修饰）：
通过选取性试剂或亲和标记试剂与酶分子侧链上特定功能基团发生化学反映。
侧链基团修饰+特定氨基酸残基侧链基团化学修饰
39、酶定向进化：
人为地创造特殊进化条件，模仿自然进化机制，在体外对基因进行随机突变，从一种或各种已经存在亲本酶（天然或者人为获得）出发，通过基因突变和重组，构建一种人工突变酶库，通过一定筛选或选取办法最后获得预先盼望具备某些特性进化酶。
定向进化=随机突变+选取
40、酶非水相催化：
酶在非水介质中进行催化作用称为酶非水相催化。
非水相酶催化特性
（1）增长非极性基质溶解度；
（2）使某些原本在水相不能进行反映顺利进行，如肽合成、酯合成等；
（3）可减少在水相容易发生副反映，如酸酐水解、卤化物水解等；
（4）容易分离回收；
（5）无微生物污染
41、有机介质中酶催化特点：
1）合用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质酶催化作用。
2）酶在有机介质中由于可以基本保持其完整构造和活性中心空间构象，因此可以发挥其催化功能
42、气相介质中酶催化
气相介质中酶催化是指酶在气相介质中进行催化反映。
特点：
1）合用于底物是气体或者可以转化为气体物质酶催化反映。
2）由于气体介质密度低，扩散容易，因此酶在气相中催化作用与在水溶液中催化作用有明显不同特点。
43、超临界流体介质中酶催化
超临界介质中酶催化是指酶在超临界流体中进行催化反映。
条件规定：
1）用于酶催化反映超临界流体应当对酶构造没有破坏作用，对催化作用没有明显不良影响；
2）具备良好化学稳定性，对设备没有腐蚀性；
3）超临界温度不能太高或太低，最佳在室温附近或在酶催化最适温度附近；
4）超临界压力不能太高，可节约压缩动力费用；
5）超临界流体要容易获得，价格要便宜等
44、有机介质反映体系
微水介质（microaqueousmedia）体系、与水溶性有机溶剂构成均一体系、与水不溶性有机溶剂构成两相或多相体系、（正）胶束体系、反胶束体系
45、机介质酶催化反映长处
因而使通过选取不同性质溶剂来调控酶某些特性成为也许。
由于引起酶变性许多因素都与水存在关于，因而在有机介质中酶稳定性得到明显提高
由于有机溶剂存在，水量减少，大大减少了许多需要水参加副反映
在有机介质中进行酶促反映，可以省略产物萃取分离过程，提高收率
46、水对有机介质中酶影响
水对有机介质中酶影响
水对酶催化反映速度影响
水活度
47、水活度（wateractivity，Aw）是指体系中水逸度（fugacity）与纯水逸度之比。
普通可以用体系中水蒸汽压与相似条件下纯水蒸汽压之比表达。
Aw=P/P0式中，P为在一定条件下体系中水蒸汽压，Po为在相似条件下纯水蒸汽压。
研究表白，在普通状况下，最适水含量随着溶剂极性增长而增长。
而最佳水活度与溶剂极性大小没关于系。
因此采用水活度作为参数来研究有机介质中水对酶催化作用影响更为确切。
一种优良培养装置应具备：
严密构造
良好液体混合性能
高传质和传热速率
敏捷检测和控制仪表
48、酶反映器:
用于酶进行催化反映容器及其附属设备称为酶反映器。
提供适当场合和最佳反映条件
49、构造分类：
搅拌式、鼓泡式、填充床、流化床、膜反映器
50、操作方式：
分批、持续、分批流加
51、酶反映器选取
依照酶应用形式选取反映器
游离酶催化反映最惯用反映器是拌罐式反映器。
对于有气体参加酶催化反映，普通采用鼓泡式反映器。
对于某些价格较高酶，由于游离酶与反映产物混在一起，为了使酶可以回收，可以采用游离酶膜反映器。
对于某些耐高温酶，如高温淀粉酶等，可以采用喷射式反映器，进行持续式高温短时反映。
依照酶反映动力学性质选取反映器
必要保证酶分子与底物分子可以有效碰撞，为此，必要使酶与底物在反映系统中混合均匀
底物浓度高低对酶反映速度有明显影响
有些酶催化反映，其反映产物对酶有反馈抑制作用
某些酶可以耐受100℃以上高温，最佳选用喷射式反映器
依照底物或产物理化性质选取反映器
反映底物或产物分子质量较大时，由于底物或产物难于透过超滤膜膜孔，因此普通不采用膜反映器
反映底物或者产物溶解度较低、粘度较高时，应当选取搅拌罐式反映器或者流化床式反映器，而不采用填充床式反映器和膜反映器，以免导致阻塞现象
反映底物为气体时，普通选取鼓泡式反映器。
有些需要小分子物质作为辅酶（辅酶可以看作是一种底物）酶催化反映，普通不采用膜反映器，以免辅酶流失而影响催化反映进行
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