瑞士乳杆菌发酵乳在贮藏中理化性质的研究Word文件下载.docx
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滴定酸度的转变……………………………………………..……………….….….11
pH的转变…………………………………………………………………………...11
游离氨基酸的转变…………………………………………………………..…..…12
粘度转变……………………………………………….………………………..….13
发酵乳在贮藏进程中蛋白含量的转变………………….………………….…..…14
发酵乳在贮藏进程中双乙酰的转变………………………………….…………...14
乳清析出量的转变………………………………………………………….……...15
发酵乳在贮藏进程中感官性状的转变…………………………………………....16
发酵乳在贮藏进程中乳酸菌总数、霉菌和酵母菌的转变…………………….….16
5结论…………………………………………………………………………….…….…18
参考文献
致谢
瑞士乳杆菌发酵乳在贮藏中的理化性质的研究
摘要：
本论文选用瑞士乳杆菌和嗜热链球菌作为混合菌种制作发酵剂，利用肯定的最佳加工工艺生产发酵乳，测定发酵乳在贮藏期间的品质转变情况，肯定了其最佳贮藏期。
关键词：
瑞士乳杆菌；
发酵乳；
贮藏；
StudyonPhysical-chemicalPropertiesofLactobacillushelveticusfermentedmilkinstorage
Abstract：
LactobacillushelveticusandStreptococcusthermophiluswereusedasmixedstarertoproducefermentedmilkbyusingtheoptimalprocessingtechnology.Qualityoffermentedmilkwasdeterminedduringstorage，andtheoptimalstorageperiodwasascertained.
Keywords:
Lactobacillushelveticus;
Fermentedmilk;
Storage;
0前言
乳与乳制品含有丰硕的高质量蛋白、乳脂肪、糖类、维生素、矿物质以及免疫活性因子等营养成份。
营养学研究表明，乳的生物学价值（人体生理上的利用率）为85%，消化率为98%。
因其营养全面而且容易吸收，乳与乳制品被以为是“接近完善的食物”[1]。
人类制作发酵乳的历史可追溯到数千年前，欧洲、亚洲和非洲的人民就知道酸牛乳比新鲜牛乳加倍稳定，具有更多长处，它可以以一种相对稳定的形式保留牛乳中高质量的营养成份。
人类食用发酵乳已经有数千年的历史，各个国家和民族几乎都有自己的传统发酵乳制品，不仅可以食用还可用于化妆品及医药品。
我国对发酵乳的开发与利用也自古有之，在我国古代多部医书名著《神农本草经》、《本草纲目》、《食养本草》和《千金食治》中对发酵乳的保健、医疗效果都有大量记叙[2]。
随着生活水平的不断提高，人们对于健康、合理和营养饮食的追求已成为现代生活中的主流。
发酵乳以其特有的营养价值和风味受到愈来愈多消费者的钟爱，酸奶是众多发酵乳产品中最广为流行的制品。
发酵乳是指用脱脂乳或全脂乳经特殊微生物发酵而制成的制品，在销售前必需维持微生物的活性，不得含有任何致病菌。
从某种意义上讲，乳的发酵是乳成份的预消化，如乳糖、蛋白质和脂肪的降解，同时可溶性钙和磷的含量提高，并合成一些B族维生素。
因此，与普通乳相较，其营养价值比较高[3]。
国际乳业联盟（IDF）专家组在1967年年会上对发酵乳作出了如下概念：
所谓发酵乳是指以乳（全脂乳、部份脱脂乳、完全脱脂乳、浓缩乳、部份脱脂乳粉或全脱脂乳粉还原乳）经均质（或不均质），杀菌（或灭菌）后，加特定的微生物发酵剂制成的一类产品[4]。
发酵乳制品是乳制品中的重要组成部份，因对人体健康有特殊的生理作用，愈来愈受到人们的关注。
市面上的发酵产品琳琅满目，但我国市场上流通较多的则是酸奶制品。
发酵乳按照成品的组织状态可以分为凝固型酸乳、搅拌型酸乳和饮用酸乳。
按成品风味分类有，天然纯酸乳、加糖酸乳、调味酸乳、果料酸乳、复合型或营养健康型酸乳等[5]。
我国目前主要生产的酸乳分为凝固型酸乳和搅拌型酸乳两大类。
在此基础上还可添加果料、蔬菜或中草药等制成风味型和营养保健型酸乳。
酸奶发酵剂是指为制作酸奶和乳酸菌饮料而调制的特定微生物的培育物，酸奶发酵剂是影响整个酸奶生产和保证发酵乳产品质量稳定的关键因素之一。
酸奶发酵剂一般由两种或两种以上乳酸菌组成。
在制作酸奶和乳酸菌饮料前，首先必需调制发酵剂，酸奶发酵剂的好坏与产品质量的好坏有极为密切的关系[6]。
以下就酸奶发酵剂选用的乳酸菌的种类及其生理功能作详细介绍。
应用于发酵乳生产的微生物主要有乳酸菌、霉菌、酵母菌等。
乳酸菌主要有乳杆菌属、链球菌属、双歧杆菌属，乳球菌属、明串珠菌属、片球菌属中的种及其亚种[7]。
目前工业化生产的菌种大约有几十种，主要的一些菌种中见表1。
表1生产发酵乳的乳酸菌种类
菌种中文名
英文名
好气性
主要机能
制作发酵乳
乳酸类型
乳链球菌
Streptococcuslactis
微好气
产酸、产香
人工酪乳、酸性奶油
L（+）
乳脂链球菌
Strlactis
产酸
双歧杆菌
Bifidobacterium
厌气性
酸奶
嗜热链球菌
Strtermophilus
保加利亚杆菌
Lacacidophllus
酸奶、克非尔
L（+）D（-）
嗜酸乳杆菌
嗜酸乳杆菌乳
乳酪乳杆菌
Laccasei
液体发酵乳
瑞士乳杆菌
Lachelvetixus
乳酸乳杆菌
Laclactis
木糖乳杆菌
Lxylosus
D（-）
乳脂明串球菌
leuconostoccremoris
产香
丁二酮链球菌
Leuconostoccremoris
弯曲乳杆菌
从世界范围来看，酸奶是发展最快的乳制品[8]，是现今乳制品开发研究的一个主流。
消费需求的增加有力地推动了发酵乳行业的发展[9]。
其发展也愈来愈引发了我国政府和社会的关注。
其良好的风味也博得消费者的喜爱。
本文旨在研究瑞士乳杆菌在贮藏期间品质特性的转变，为发酵乳的规模性贮藏奠定了基础，而且为该产品大规模生产提供参考依据。
1材料与仪器
材料
新鲜牛乳：
由XXX大学实验场提供
菌种：
瑞士乳杆菌（Lactobacillushelveticus）购于中国工业微生物菌种保藏中心
嗜热链球菌（Streptococcusthermophilus）新疆XXX农垦科学院提供
培育基
NFM培育基
称取11g脱脂乳溶解到100mL的蒸馏水中，自然pH值，115℃，灭15min。
MRS培育基
1升蒸馏水中溶解15g琼脂（加热溶解），再加入以下成份：
蛋白胨10g，肉膏10g，酵母浸取物5g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温1mL，磷酸氢二钾2g，MgSO4·
7H2Og，MnSO4·
4H2Og。
然后调～，121℃,15min灭菌。
主要试剂与仪器设备
实验顶用到的主要药品如表2所示：
表2实验用试剂
名称
级别
产地
％溴甲酚绿
AR
西安化学试剂厂
邻苯三酚
BR
天津市光复精细化工研究所
甲醇
安徽安特生物化学有限公司
邻苯二甲醛
茚三酮
异亮氨酸
西安天一生物技术有限公司
其他：
酚酞指示剂；
浓硫酸；
磷酸缓冲液；
LNaOH溶液
实验顶用到的主要仪器设备如表3所示：
表3实验用仪器设备
仪器名称
型号
生产厂家
手提式压力蒸汽灭菌器
TXQ-SG41-208A
上海医用核子仪器厂
数显不锈钢电热培养箱
HPX-9272MBE
上海博迅求有限公司医疗设备厂
pH计
SJ-4A
上海雷磁有限公司
净化工作台
SW-CS-2F
苏州安泰空气技术有限公司
数字式黏度计
NDJ-5S
上海精密科学仪器有限公司
紫外可见分光光度计
UV-2100
尤尼柯（上海）有限公司
电子天平
DL203
精密电子天平
BS224S
北京赛多利斯仪器系统有限公司
离心机
5415D
德国eppendorf公司
冰箱
DCD-216YH
青岛海尔股份有限公司
显微镜
XS-213A
南京江南光电股份有限公司
2发酵乳制作工艺[10]
原料乳→配料→均质→杀菌→冷却→加发酵剂→装瓶、发酵→冷却→成熟→贮藏
工艺要点[11]：
原料乳：
选用符合质量要求的新鲜乳、脱脂乳为原料。
抗菌物质查验应为阴性，因为乳酸菌对抗生素极为敏感，乳中微量的抗生素都会使乳酸菌不能生长繁衍。
配料：
为提高干物质含量，可添加脱脂乳粉。
蔗糖加入量为7%。
适当的蔗糖对菌株产酸有利，但不能过量，不然抑制乳酸菌产酸，增加本钱。
均质：
原料配合后，进行均质处置。
均质有利于提高酸乳的稳定性和稠度，并使发酵乳质地细腻，口感良好。
杀菌及冷却：
均质后的物料以90℃进行10分钟杀菌，目的是杀死病原菌及其他微生物；
使乳中酶的活力钝化和抑菌物质失活。
杀菌后的物料应迅速冷却到45℃左右。
加发酵剂：
将活化的发酵剂（瑞士乳杆菌与嗜热链球菌）充分搅拌，以1:
1的比例加入。
混合发酵剂能产生良好的的效果并能缩短发酵时间。
装瓶、发酵：
装瓶前对其进行蒸汽灭菌。
发酵时，温度维持在40℃～44℃，培育时间～h。
达到凝固状态时即可终止发酵。
冷却、后熟：
发酵好的凝固酸乳，应当即放入4℃的冰箱中，迅速抑制乳酸菌的生长，以避免继续发酵而造成酸度太高。
3瑞士乳杆菌发酵乳在贮藏进程中理化性质及微生物指标的转变
发酵乳理化指标的测定
滴定酸度的测定
最佳配比的发酵乳样品以酚酞为指示剂，用浓度为mol/L的NaOH标准溶液滴定。
滴定值以吉尔涅尔度（oT）表示，即每100mL样品消耗NaOH溶液的毫升数。
pH值的测定
样品用通过标准缓冲溶液标定的实验室pHSJ～4A型pH计进行测定。
做三次平行实验，终结果取平均值。
游离氨基酸的测定
将活化好的瑞士乳杆菌接种于灭菌的100mL11%的脱脂乳中发酵，然后贮藏，并每隔5天在570nm下测定其吸光值。
测按时，取瑞士乳杆菌发酵乳10mL于烧杯中，加入约50mL蒸馏水和5g左右的活性炭，加热煮沸，过滤，用30～40mL热水洗涤活性炭，搜集滤液于100mL容量瓶，加水至标线。
取20mL，加入1mLpH的磷酸缓冲液和1mL2％的茚三酮，以水定容，水浴15分钟，静止冷却至室温。
570nm下，以未发酵乳为参比液测定溶液的吸光度。
同时绘制氨基酸含量标准曲线。
水解蛋白活力以氨基酸总量表示（μg/mL）。
计算公式：
氨基酸总量=m/v（μg/mL）
式中：
m：
从标准曲线上查的氨基酸的质量，μg；
v：
测定的样品溶液相当于样品的体积，mL。
2％茚三酮溶液的配置
称取茚三酮1g于盛有35ml热水的烧杯中使其溶解，加入40mg氯化亚锡（SnCl2·
H2O）搅拌过滤（作为防腐剂）。
滤液置冷暗处留宿，加水至50ml，摇匀备用。
磷酸缓冲液的配置
准确称取磷酸二氢钾（KH2PO4）g于烧杯中，用少量水溶解，定量转入500ml容量瓶中，用水定容摇匀备用。
然后再准确称取磷酸氢二钠（Na2HPO4）g于烧杯中，少量水溶解后，定量转入500ml容量瓶中，以水定容摇匀备用。
取上述配好的磷酸二氢钾溶液ml与190ml磷酸氢二钠溶液混合均匀即为的磷酸缓冲液[12]。
氨基酸标准溶液的配置
准确称取干燥的异亮氨酸g于烧杯中，先用少量水溶解后，定量转入100ml容量瓶中，用水稀释至标线，瑶匀。
准确吸取此溶液ml于100ml容量瓶中，加水至标线，摇匀，即为200μg/ml氨基酸标准溶液。
标准曲线的绘制
准确吸取200μg/ml异亮氨酸标准溶液、、、、、、，别离置于25ml容量瓶中，各加水补充至容积为ml，然后加入茚三酮和磷酸缓冲液各1ml，混合均匀，水浴加热15min，掏出迅速冷却至室温，以水定容摇匀。
静止15min后，在570nm波长下，以试剂空白为参比液测定各溶液的吸光度A。
以异亮氨酸的微克数为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制氨基酸标准曲线。
黏度的测定[13]
发酵乳的黏度选用NDJ-5S数字式黏度计测定，将放在冰箱贮藏的发酵乳，从贮藏时起天天用旋转黏度计别离测定发酵酸乳的黏度（mPa·
s）。
测按时每15s取值一次,测按时间为3min。
每一个样品做三个平行试样，结果取算术平均值。
凯氏定氮法
用于酸奶中蛋白质含量的测定。
取发酵乳15ml，别离加入g的CuSO4，3gK2SO4，再沿瓶壁加入20ml的浓H2SO4。
在消化瓶口放一小漏斗，并使消化瓶呈45˚斜置。
用小火缓慢加热使溶液维持在沸点以下，等泡沫停止，慢慢加大火力，待溶液呈透明的绿色，继续加热10min，自然冷却。
然后取3%硼酸溶液10ml置于100ml锥形瓶中，加混合指示剂5滴，将消化液经漏斗转入蒸馏瓶中，用少量水再次淋洗消化瓶及漏斗数次，再加入30%NaOH溶液10ml，用少量水再次淋洗漏斗数次，加热进行蒸馏。
至硼酸溶液开始由酒红色变成蓝绿色起计时，继续蒸馏10min，用N盐酸滴定。
蛋白质（%）=（V×
N×
×
100）/W
式中:
V—滴定所消耗盐酸标准溶液的亳升数；
N—标准盐酸的浓度（N）；
—1mol/L盐酸标准溶液1ml相当于氮的克数；
—蛋白质质换系数；
W—样品克数
酸奶样品中双乙酰含量的测定
蒸馏：
取一25ml量筒，置于蒸馏装置冷凝器下端管口，于250ml三角瓶中加入100ml酸奶样品，再加50ml水，迅速放入已预先加热的滚水中，进行蒸馏，直到馏出液接近25ml时取下量筒，用蒸馏水定容至25ml。
反映：
别离吸取馏出液10ml于2个试管中，第一个放入ml邻苯二胺溶液，充分振荡混合后置于暗处放置20min，再加入4mol盐酸2ml，第二个管内加入4N盐酸ml，混均。
测定：
用紫外分光光度计于335nm波长下，用2cm石英比色杯以第二管为空白，测定第一管的吸收值，测定进程要在20min内完成。
双乙酰含量的计算公式如下：
双乙酰（ppm）=E×
E—吸收值；
—换算系数；
—校正系数
乳清析出量的测定
采用胶体脱水收缩作用敏感性（susceptibilitytosyneresis，STS）的测定方式测定。
常温下，将约50g发酵成熟后的发酵乳小心倒入已装好滤纸的漏斗中，用100ml量筒搜集滤出的乳清。
搜集时间为40分钟，最后对搜集的乳清称重。
发酵乳对胶体脱水收缩作用敏感性＝（乳清析出量/样品重量）×
100％
发酵乳的感官评价方式[14]
表4感官评定指标
指标
标准
分数
具有酸乳特有的细腻、润滑及稠厚感、爽口
25--30
口感（30分）
较细腻、润滑，稠厚感不强或较为稀薄
15－24
较为粗糙，有沙粒状或沙状口感，或如饮水状
<
15
有发酵乳特有的滋气味，酸甜适口，风味协调
35－40
滋味和气味（40分）
风味较淡，酸甜适口，勉强接受
20—34
风味淡薄，气味不协调，不能接受
20
凝乳均匀，无杂质，无或有少量乳清析出
25—30
组织状态（30分）
凝乳较均匀，有乳清析出
15—24
凝乳不均匀，乳清严重析出
由一路实验的同窗8人组成感官评定小组，别离从口感滋味和气味和组织状态三个方面对发酵乳样品进行评定。
采用百分制分方式评分。
评定方式：
取适量试样于50mL烧杯中，在自然光下观察色泽和组织状态，再闻气味，然后用温开水漱口，品尝样品的滋味。
发酵乳微生物指标的测定（用倾注平板计数法计数）
乳酸菌总数的测定[15]
用MRS培育基；
无菌吸取发酵乳25ml放入含有225ml的灭菌液中，做成1:
10的稀释液。
用灭菌移液管吸取lml，注入到入9mL无菌水的试管中，进行10倍梯度的稀释，此液为1:
100稀释液。
选择适宜稀释梯度，注入15ml于MRS培育基上，每一个稀释度做3个平行样，转动平皿混合均匀，同时将MRS培育基中倾入加有1ml无菌水的灭菌平皿内做空白。
放于培育箱内，37℃，培育48h，掏出后进行菌落计数。
霉菌酵母菌的测定[16]
马铃薯葡萄糖琼脂培育基（PDA）
取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000mL。
80℃浸泡1h，用纱布过滤，然后补足失水至所需体积。
加入20g葡萄糖，2g丙酸钠，加热煮沸后加入20g琼脂继续加热融化并补足失水。
121℃灭菌20min。
霉菌菌落总数的测定:
测定方式:
无菌吸取发酵乳25ml加入225mL灭菌稀释液，充分摇匀，即为1:
10稀释液。
选择适宜稀释梯度，吸取1ml于马铃薯葡萄糖琼脂培育基上，每一个稀释度做3个平行样，转动平皿混合均匀，同时将葡萄糖琼脂培育基中倾入加有1ml无菌水的灭菌平皿内做空白。
结果计算方式如下:
菌落数（CFU/mL）=平皿菌落数×
10×
稀释倍数
4结果与分析
在前期的实验中，通过做正交实验并对它进行分析，肯定了发酵的最佳接种量、接种比例、发酵温度及最佳杀菌时间。
从而为发酵乳贮藏奠定了基础。
瑞士乳杆菌和嗜热链球菌混合发酵生产发酵乳的最优发酵条件是：
菌种比例为（瑞士乳杆菌:
嗜热链球菌）1:
1，培育时间6h，接种量4%，杀菌条件为90℃、10min，加糖量为7%，培育温度为40℃，均质压力为18Mpa。
瑞士乳杆菌发酵乳贮藏的理化性质的测定就是在这最优工艺的前提下完成。
滴定酸度的转变
发酵乳的初始酸度低，贮藏一天后，滴定酸度转变比较明显，由980T上升到1110T，图示1明显。
但在1-3天的贮藏中滴定酸度上升趋势缓慢，从第三天后，增加趋势明显。
发酵乳随贮藏时间的延长，滴定酸度迅速升高。
由本实验可以看出随着贮藏天数的延长，酸奶的后酸化现象愈来愈严重。
图1在贮藏进程中酸度的转变
pH的转变
pH是指通常意义上溶液酸碱程度的衡量标准，pH值越小说明酸性很强，越大说明碱性很大。
由图2测定的数值可以看出，发酵乳在贮藏初始其pH值较高，随贮藏时间的延长，菌体乳糖代谢产生乳酸的能力大于分解蛋白质的能力，表现为pH值不断下降。
图
2图2在贮藏进程中pH的转变
游离氨基酸的转变
食品营养价值的高低，除与蛋白质含量有关外，还主要取决于所含氨基酸的数量、种类和组成比例等，特别是必需氨基酸。
因此，了解瑞士乳杆菌的蛋白水解活力对提多发酵乳的营养价值有很重要的意义。
氨基酸含量标准曲线如图3所示，对照标准曲线得动身酵乳中氨基酸含量如图4所示。
图3氨基酸含量标准曲线
图4贮藏中氨基酸含量
上图所示为瑞士乳杆菌发酵乳水解蛋白活力的转变。
在发酵方才结束时，氨基酸含量为103μg/mL，以后随着贮藏时间的延长，氨基酸含量不断上升。
在第5天时，含量达到156μg/mL。
在第10天时，氨基酸含量达到182μg/mL，在以后5天内，氨基酸含量维持相对增加的状态。
黏度转变
图5在贮藏进程中粘度的转变
发酵乳的黏度并非是越黏越好，而是有一个最佳范围，这个最佳范围是通过对市场流行的优质酸奶普查得出的，结果是4428～4725[17]。
由图5可以看出，随贮藏天数的增加，发酵乳由刚结束的5100下降为贮藏第十三天的2990。
发酵乳制品黏度的产生是由于菌体不断产酸使pH值下降到酪蛋白凝固点，同时菌体不断分泌粘多糖，使发酵乳呈现均一粘稠状态，但在贮藏进程中，由于酸度的继续下降，使蛋白质交联被破坏，从而使黏度有所下降，感官质量也随之降低。
发酵乳在贮藏进程中蛋白含量的变化[18]
图6贮藏期间蛋白质含量
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