Agilent1100高效液相色谱仪操作规程Word下载.docx

Agilent1100高效液相色谱仪操作规程Word下载.docx

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成孔性能好，亲水性好，材料成本低。

可耐稀酸。

不适合于酮类、酯类、强酸、强碱类液体过滤。

聚酰胺类

尼龙6

（PA-6）

通用

具有亲水性，较耐碱不耐酸。

在酮、酚、醚及高分子醇类不被腐蚀。

聚砜类

聚砜（PS）

良好的化学和热稳定性，耐辐射，机械强度高。

聚偏氟乙烯/聚四氟乙烯膜

PDEF/PTFE

有机

PDEF耐化学腐蚀，耐氧化，耐高温，疏水性（酒精处理后变清水性），PTFE耐酸碱性强。

聚烯烃类

聚丙烯膜（PP）

具有良好的化学稳定性，耐酸碱和各种有机溶剂。

价格便宜，但孔径分布宽。

无机材料

陶瓷、玻璃BP、金属膜

耐高温，耐有机溶剂、耐生物降解等。

2.基本操作步骤:

（一）、开机：

1、打开计算机,进入中文WindowsXP画面,并运行CAGBootpServer程序（部分安装程序不需要运行Bootp）。

2、打开1200LC各模块电源。

3、待各模块自检完成后，双击“仪器1联机”图标，化学工作站自动与1200LC通讯，进入的工作站画面如下所示。

4、从“视图”菜单中选择“方法和运行控制”画面,点击“视图”菜单中的“仪器实际值”，“在线光谱”，“化学工作站状态”，“系统视图”,“样品视图”，使其命令前有“√”标志，来调用所需的界面。

5、把流动相放入溶剂瓶中。

6、打开冲洗阀。

7、点击“泵”图标，点击“设置泵…”选项，进入泵编辑画面。

8、设流速：

5ml/min，点击“确定”。

9、点击“泵”图标，点击“控制…”选项，选中“启动”，点击“确定”，则系统开始冲洗，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止,切换通道继续冲洗，直到所有要用通道无气泡为止。

10、点击“泵”图标，点击“控制…”选项，选中“关闭”，点击“确定”关泵，关闭冲洗阀。

11、点击“泵”图标，点击“设置泵…选项”，设流速：

例如1.0ml/min。

12、点击泵下面的瓶图标，如下图所示（以单元泵为例），输入溶剂的实际体积和瓶体积。

也可输入停泵的体积，点击“确定”。

13、点击“泵”图标，点击“泵辅助设定…”，设定“最流速梯度”，“最小冲程”，“压缩因子”，“主通道”。

（二）、数据采集方法编辑：

1、开始编辑完整方法：

●从“方法”菜单中选择“编辑完整方法…”项，如下图所示选中除“数据分析”外的三项，点击“确定”，进入下一画面。

2、方法信息：

●在“方法注释”中加入方法的信息（如：

测试方法）。

●点击“确定”，进入下一画面。

3、泵参数设定：

（以四元泵为例）

●在“流速”处输入流量,如1ml/min，在“溶剂B”处输入80.0,（A=100-B-C-D）,也可“插入”一行“时间表”,编辑梯度。

在“压力限”处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。

●点击“确定”，进入下一画面。

4、自动进样器参数设定:

（以标准G1329A为例）

●选择合适的进样方式,如图所示，进样体积5.0ul,洗瓶位置为6号。

“标准进样”----只能输入进样体积，此方式无洗针功能。

“洗针进样”----可以输入进样体积和洗瓶位置，此方式针从样品瓶抽完样品后，会在洗瓶中洗针。

“使用进样器程序”---可以点击“编辑”按钮进行进样程序编辑。

●“最优化”有“无”，“重叠进样周期”和“预取进样瓶”，可以根据实际情况选择。

●点击进“确定”，进入下一画面。

5、柱温箱参数设定:

●在“温度”下面的空白方框内输入所需温度,如：

40度。

并选中它,点击“更多>

>

”键,如图所示,选中“与左侧相同”，使柱温箱的温度左右一致。

6、检测器参数设定:

6.1、VWD检测器

●在“波长”下方的空白处输入所需的检测波长,如254nm,在“峰宽（响应时间）”下方点击下拉式箭头,选择合适的响应时间,如>

0.1min（2s）。

●在“时间表”中可以“插入”一行，输入随时间切换的波长，如1min，波长=300nm。

点击“确定”，进入下一画面。

6.2、DWD检测器

7、在“运行时选项表”中选中“数据采集”，点击“确定”。

8、点击“方法”菜单，选中“方法另存为…”，输入一方法名，如“测试”，点击“确定”。

9、从菜单“视图”中选中“在线信号”,选中“信号窗口1”,然后点击“改变…”钮,将所要绘图的信号移到右边的框中,点击“确定”。

（如同时检测二个信号,则重复此操作,选中“信号窗口2”。

单击“改变”键，即可弹出右侧的“编辑信号图谱”窗口，进而选择所需的谱图信号。

10、点击“确定”,从“仪器”菜单选择“系统开启”。

（三）、序列的设置

1、从“序列”菜单中，打开“序列表…”，光标至于“行1”，单击“剪切”，去除“行1”，再单击“插入/批量输入向导”。

2、设置“操作”为“追加”，“开始位置”为“1”，“插入行数”为所需的样品数，如“3”，“方法名称”为“测试”，“样品名称”为“排毒清脂片”，“进样次数”为“3”，“样品类型”为“样品”或“标准物质”“质控物质”，点击“确定”：

3、光标至于“行3”、单击“追加一行”，设置冲洗仪器和色谱柱的样品和方法，“方法名称”选择已经设置好的“水醇洗柱”。

4、单击“确定”，完成序列设置。

5、从“序列”菜单中，打开“序列参数”选项，如下图所示，输入操作者名称，如“安装工程师”；

在“数据文件”中选择“手动”或“前缀/计数器”，单击“确定”，完成设置。

6、从“序列”菜单中，打开“保存序列”选项，输入“文件名”，如“测试”，单击“确定”，完成设置。

7、等仪器准备好，基线平稳，从“运行控制”菜单中选择“运行序列”，进样（或者从操作界面上点击“开始”，进样）。

（若无自动进样

器，则基线平稳后，进样并搬动手动进样阀，启动运行。

）

（DAD,VWD色谱图如下所示：

（四）、数据分析方法编辑:

1、从“视图”菜单中，点击“数据分析”进入数据分析画面。

2、从“文件”菜单选择“调用信号”，选中您的数据文件名，如下图所示。

点击“确定”，则数据被调出。

3、做谱图优化：

从“图形”菜单中选择“信号选项”，如下图所示。

从“范围”中选择“满量程”或“自动量程”及合适的时间范围或选择“自定义量程”调整。

反复进行，直到图的比例合适为止。

点击“确定”。

4、积分:

●从“积分”菜单中选择“积分事件”选项，如下图所示。

选择合适的“斜率灵敏度”，“峰宽”，“最小峰面积”，“最小峰高”。

●从“积分”菜单中选择“积分”选项，则数据被积分。

●如积分结果不理想，则修改相应的积分参数，直到满意为止。

●点击左边“√”图标，将积分参数存入方法。

5、打印报告:

●从“报告”菜单中选择“设定报告”选项，进入如下图所示画面。

●点击“定量结果”框中“计算”右侧的黑三角，选中“面积百分比”，其它选项不变。

●点击“确定”。

●从“报告”菜单中选择“打印报告”，则报告结果将打印到屏幕上，如想输出到打印机上，则点击“报告”底部的“打印”钮。

（四）、关机:

●关机前，先关灯，并必须用相应的溶剂充分冲洗系统。

●退出化学工作站，依提示关泵，及其它窗口，关闭计算机。

●关闭Agilent1200各模块电源开关。

（五）、Agilent1200LC维护保养：

1、色谱柱长时间不用，存放时，柱内应充满溶剂，两端封死（如乙腈/甲醇适于反相色谱柱，正相色谱柱用相应的有机相）。

2、手动进样器，当使用缓冲溶液时，要用水冲洗进样口。

3、流动相使用前必须过滤，不要使用多日存放的蒸馏水（易长菌）。

4、带seal-wash的1200，要配制90%水+10%异丙醇，开启seal-wash清洗泵，溶剂不能干涸。

5、注意事项见说明书，或由现场工程师介绍。

（六）、维护知识问答

1、为什么溶剂和样品要过滤?

溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。

色谱柱：

由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。

仪器：

溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。

2、为什么HPLC用缓冲盐时要加在线Seal-wash选项？

HPLC用缓冲盐时,由于泵头内的缓冲盐溶液存在高压析盐现象,析出的细小盐粒非常坚硬,它附着在蓝宝石活塞杆上,随着蓝宝石活塞杆的往复运动,容易产生划痕,并磨损密封垫,造成漏液等故障现象。

在线Seal-wash选项能有效的带走可能存在的缓冲盐结晶。

缓冲盐的浓度在0.1mol或大于0.1mol时,必须使用该在线冲洗选项.

清洗液配制:

90%水+10%异丙醇.该混合液可抑制菌类生长和减小水的表面张力，不能干涸。

3、为什么Agilent1200LC的流动相管路非常细?

在使用HPLC时,应特别注意”柱外效应”对分析结果的影响，由于样品分子在液体流动相中的扩散系数比在气体中小4～5个数量级，液体流动相的流速也比气相慢1～2个数量级。

因此，样品进入色谱柱后，在柱子以外的任何死体积（进样器、柱接头、连接管、检测器）中，样品分子的扩散和滞留，都会引起色谱峰的展宽，而使柱效降低。

为使柱外效应减之最小，获得理想的分析结果，Agilent1200LC使用加工工艺难度高的毛细管线作为流动相管路。

毛细管线分类：

0.17mm内径------绿色;

0.12mm内径-------红色。

PEEK管线：

内径-----0.13mm;

0.18mm;

0.25mm;

0.5mm。

毛细管线优点:

柔韧性好.

***Agilent公司同时备有1/16in的粗外径毛细管线,适用于不同习惯的用户,优点是刚性好,但柔韧性差一些。

4、流动相使用前为什么要脱气？

流动相使用前必须进行脱气处理，以除去其中溶解的气体（如O2），以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。

气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。

溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。

若用FLD，可能会造成荧光猝灭。

常用的脱气方法比较：

氦气脱气法：

利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。

加热回流法：

效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。

抽真空脱气法：

易抽走有机相。

超声脱气法：

流动相放在超声波容器中，用超声波振荡10-15min，此法效果最差。

在线真空脱气法：

Agilent1200LC真空脱机利用膜渗透技术，在线脱气，智能控制，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。

5、如何防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞，以及堵塞后的处理？

溶剂的质量或污染以及藻类的生长会堵塞溶剂过滤器，从而影响泵的运行，尤其水溶液或磷酸盐缓冲液（PH=4—7）。

以下几种方法可以有效防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞。

A：

请严格执行溶剂过滤。

B：

请勿使用多日存放的蒸馏水及磷酸盐缓冲液

C：

如果应用许可，可在溶剂中加入0.0001---0.001M的叠氮化钠.

D:

在溶剂瓶内溶剂的上方小流量连续吹氩气,以隔绝空气。

E：

避免使溶剂瓶暴露在直射阳光下，尽量使用琥珀色的溶剂瓶盛放水溶液或磷酸盐缓冲液。

6、Agilent1200LC泵如何维护？

Agilent1200LC泵给色谱柱提供稳定、无脉动、流量准确的流动相，及时合理的维护非常重要。

流动相使用前请必须脱气、过滤。

使用缓冲盐时，要加在线Seal-wash选项。

关机前，用相应的溶剂充分冲洗系统。

D：

及时更换PurgeValve内的过滤芯。

（当打开PurgeValve时，压力高于10bar，表明过滤芯已堵）。

E：

使用合适的密封圈。

7、如何选择合适的泵头活塞密封圈？

泵头活塞的标准密封圈能适合于大多数应用，但使用正相溶剂（如正己烷），不适合使用标准活塞密封圈，特别是长时间使用时，需更换另一种不同的密封圈，我们建议使用聚四氟乙烯密封圈。

（p/n0905-14202/pk）

***注意：

聚四氟乙烯密封圈的压力范围为：

0—200bar；

建议在泵的压力限制中，将最大压力设为200bar。

8、使用梯度比例发时要注意那些事项？

当盐溶液与有机溶剂溶液混合时，盐溶液能与有机溶剂溶液完全混溶，而不会出现沉淀。

但是在比例阀的混合点，重力作用使盐颗粒沉淀下来，通常，阀A接水相/盐溶液，D接有机溶剂，此法连接可有效使盐回落到盐溶液中，并被溶解。

若颠倒过来，盐可能落在有机溶剂中，出现问题。

强烈建议：

当使用缓冲盐溶液和有机溶剂时，推荐将缓冲盐通道接在A通道上，有机溶剂通道直接接在A通道的上方D通道上；

定期用水冲洗所有的通道，以除去阀口上可能出现的盐沉淀。

9、更换色谱柱时要注意什么事项?

在使用HPLC时,应特别注意”柱外效应”对分析结果的影响，由于样品分子在液体流动相中的扩散系数比在气体中小4~5个数量级，液体流动相的流速也比气相慢1-2个数量级。

因此，样品进入色谱柱后，在柱子以外的任何死体积（进样器、柱接头、连接管、检测器）中，样品分子的扩散和滞留，都会引起色谱峰的展宽，而使柱效降低。

为使柱外效应减之最小，获得理想的分析结果，仪器的流动相管路连接非常重要,一般Agilent1200LC在第一次安装时,均有受过专业培训的安装工程师负责安装,各种接头会处理的非常完美。

客户只需在更换色谱柱时注意接头处理就可以了，一般柱子入口接头为不锈钢卡套接头，柱子出口为不锈钢卡套接头或PEEK管线手拧接头，当完成第一次安张后，不锈钢卡套已固定死，当接不同的柱子时，要注意柱子接头处的形状和长度，否则会产生一个非常大的死体积。