大肠菌群测定的操作细则汇总Word文档格式.docx
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按GB4789.28中4.10规定。
2.4EC肉汤:
按GB4789.28中4.11规定。
2.5磷酸盐缓冲稀释液:
按GB4789.28中3.22规定。
2.6生理盐水。
2.7革兰氏染色液:
按GB4789.28中2.2规定。
3操作步骤
3.1检样稀释
3.1.1以无菌操作将检样25mL（或g）放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内予置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:
10的均匀稀释液。
固体检样最好用均质器,以8000-10000r/min的速度处理1min,做成1:
3.1.2用1mL灭菌吸管吸取1:
10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:
100的稀释液。
3.1.3另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。
3.1.4根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管。
3.2乳糖发酵试验
将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。
每一稀释度接种3管,置36±
1℃温箱内,培养24±
2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。
3.3分离培养
将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36±
1℃温箱内,培养18-24h,然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。
3.4证实试验
在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置36±
1℃温箱内培养24±
2h,观察产气情况。
凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。
3.5报告
根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL（g）大肠菌群的MPN值。
4粪大肠菌群（faecalcoliform）
4.1用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物（见3.2条）转种于EC肉汤管内,置44.5±
0.2℃水浴箱内（水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面）,培养24±
2h,经培养后,如所有EC肉汤管均不产气,则可报告为阴性;
如有产气者,则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上,置培养18-24h,凡平板上有典型菌落者,则证实为粪大肠菌群阳性。
4.2结果报告
根据证实为粪大肠菌群的阳性管数,查MPN检索表,报告每100mL（g）粪大肠菌群的MPN值。
大肠杆菌O157:
H7实验诊断研究进展
H7感染临床表现
出血性肠炎：
鲜血样便，腹部痉挛性疼痛，低热或不发热。
溶血性尿毒综合征（HUS）：
主要发生在儿童，常出现在腹泻后数天或1-2周。
病死率一般在10%，各别可高达50%。
血栓性血小板减少性紫癜（TTP）：
主要发生在成年人，尤其老年人。
病人主要表现为发热、血小板减少、溶血性贫血、肾功能异常等症状，病情发展迅速，病死率高，有时可出现70%的病人死亡。
H7传染源和传播途经
H7基本上是一种食源性病原菌，可通过食用大肠杆菌O157:
H7污染的牛肉、牛奶、牛肉或制品、鸡肉、蔬菜、水果、饮料、水等感染,也可通过人与人、人与动物密切接触传播。
在实验室，大肠杆菌O157:
H7可以感染小鼠、鸡、兔、猪、牛等动物。
H7的感染已成为世界性的问题
我国情况也不容乐观
一、细菌培养与鉴定
1．分离培养
早期培养对确定病原有重要意义。
培养的对象首先是急性血性腹泻患者，其次是HUS、TTP等住院病人，再其次是高危接触者。
培养基：
山梨醇麦康凯琼脂、胰胨大豆琼脂
改良的伊红美兰、改良的SD-39（MSD）琼脂
添加了头孢克肟和亚碲酸钾的山梨醇麦康凯琼脂（TC-SMAC）
添加了头孢克肟和鼠李糖（0.5%）的山梨醇麦康凯琼脂（CR-SMAC）
“科玛嘉”大肠杆菌O157:
H7显色培养基
四溴荧光亚甲基兰琼脂
H7抗血清—山梨醇发酵培养基
增菌液：
含10mg/L新生霉素的EB肉汤或肠道增菌液
含10mg/L新生霉素或10mg/L盐酸-吖啶黄的胰蛋白胨大豆肉汤
新生霉素MEC肉汤
月桂基胰蛋白胨肉汤
加入下例任何一种抑制剂均可增加培养基的选择性
头孢克肟0.05mg/L亚碲酸钾2.5mg/L
新生霉素10mg/L万古霉素40mg/L
2．免疫磁珠分离法
免疫磁珠分离法是将特异性抗体吸附于一种能被吸附的磁性珠子上,然后利用抗原抗体反应特性将样品中的大肠杆菌O157:
H7富集起来。
方法:
1.增菌;
2.取样品1ml加大肠杆菌O157:
H7免疫磁珠20ul;
3.轻轻混合10分钟;
4.将试管插入磁架上;
5.吸取上清;
6.加PBS,重复3-5过程;
7.取管壁沉淀物,划线接种于CT-山梨醇麦康凯琼脂（C-头孢克肟,T-亚碲酸钾）等选择性培养基。
37℃培养6-24小时，挑取可疑菌落进行鉴定。
Chapman等共检测大便标本690份,免疫磁珠分离法检出25。
用免疫磁珠分离法分离的l2株大肠杆菌O157:
H7中,直接培养阳性仅5株。
Wright等将接种大肠杆菌O157:
H7的碎牛肉标本置加有万古霉素和头孢克肟的缓冲蛋白胨水培养,然后直接或用大肠杆菌O157抗体包被的磁珠分离细菌后,接种于CT-SMAC,结果直接次培养检出量为200cfu/g,而免疫磁珠分离法仅需2cfu/g。
Chapman等先用EC肉汤增菌,然后用免疫磁珠分离法富集牛粪便大肠杆菌O157:
H7菌株,再用选择性培养基分离，并与CR-SMAC和CT-MAC直接培养作比较。
用前者检测接种12株不同大肠杆菌O157:
H7菌株的牛粪便悬液,其敏感性比在两种培养基上直接培养高100倍。
Cubbon等用免疫磁分离法（IMS）检测牛粪便和食品标本的大肠杆菌O157:
H7。
在一起经牛奶传播的大肠杆菌O157:
H7爆发中,用IMS、粪便培养和多聚酶链反应（PCR）检测Vero毒素基因的携带,用三种方法对粪便大肠杆菌O157:
H7的分离率作比较结果,在受检的142份粪便标本中,直接培养和IMS均阳性20份,另13份仅IMS阳性。
因此,IMS提高了大肠杆菌O157:
H7感染病例的检出率,与PCR符合率高。
目前，污染的肉、家畜，甚至饮用水均面临大肠杆菌O157:
H7的卫生威胁。
检测食品和水源中肠道病原体使用传统的培养法,结果不理想。
IMS和其它检测的研究表明,对快速检测食品和环境标本似乎前景良好,Yu检等以IMS结合电化学发光检测法（ECL）检测食品和污染物中的大肠杆菌。
结果显示,在原缓冲液检出大肠肠菌的范固为100－1000cfu/lm,在食品检出的范围为1000－2000cfu/lm，检测时间十分快,一般不到1小时。
菌O157:
在监测牛群的4个月间,从牛采集1024份直肠标本,其中检出大肠杆菌O157:
H784份（8.2%）84份中有23份（27.4%）由直接培养和IMS分离。
23份中15份由两种培养基、5份仅由CT-SMAC、3份仅由CR－SMAC分离,其余61份（72.6%）仅IMS分离。
用含吐温－20的PBS洗涤磁珠可减少其它微生物与磁珠的非特异性结合。
用无关的抗体包被磁,则大肠杆菌O157:
H7不结合。
IMS具有快速、操作简单、特异性高,在流行病学调查中有价值。
3．生化反应
目前许多国家使用的O157和H7特异性抗体与极少数细菌具有不同程度交叉反应。
因此用生化试验确定为大肠杆菌是必须的。
典型大肠杆菌的主要生化反应结果如下：
动力试验（+）葡萄糖（+）麦芽糖（+）甘露醇（+）蔗糖（－/+）硫化氢（－）尿素（－）靛基质（+）甲基红（+）V-P试验（－）枸橼酸盐（－）苯丙氨酸脱羧酶（－）赖氨酸脱羧酶（+/－）鸟氨酸脱羧酶（+/－）氧化酶（－）氰化钾（－）
与O157有鉴别意义的生化反应见表1。
MUG即4-甲基伞形化内酯-β-葡萄糖醛酸苷。
大多数大肠杆菌具有葡萄糖醛酸酶,可水解MUG产生荧光,但O157:
H7中大多数菌株则不水解MUG。
Thompson等建立了一种快速MUG试验,取MUG试剂0.5ml置试管中,以无菌棉签挑取待检菌纯培养物混匀于其中,44.5℃置20min,暗室内高强度光源下观察结果,产生蓝色荧光者为阳性。
二．血清学检测
1．玻片凝集试验
2.胶体金免疫技术
3.ELISA
4．免疫荧光技术
5．胶乳凝集
6.间接血凝分析（IEHA）
7.全自动抗原抗体检测系统
8.免疫印记法
玻片凝集试验是鉴定O抗原最经典的方法,实验中如果凝集反应不明确，但根据临床表现和生化反应等菌株高度可疑时,可100℃加热菌液30min再行玻片凝集试验。
这样可去除K抗原的影响。
为排除交叉反应引起的凝集造成假阳性,应继而做试管凝集反应,所测得的效价不应低于诊断血清原标定效价的一半。
鉴定H抗原也应同时做玻片和试管凝集试验,并应先对待检菌做动力试验,在动力活泼时取培养物做H抗原鉴定。
胶体金免疫技术特点是以胶体金作为标记物进行的抗原抗体反应。
这一技术最初用于免疫电镜技术。
至今，在免疫测定中，金标记常与膜载体配合，形成特定模式，典型的如斑点免疫渗滤试验和斑点免疫层析试验等，已是目前应用广泛的一种简便、快速的血清学检验方法。
胶体金的制备多采用还原法，氯金酸是主要还原材料。
金颗粒的大小取决于制备时加入的柠檬酸三钠的量。
胶体金免疫层析试验时以硝酸纤维膜为载体，利用了微孔膜的毛细管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，犹如层析一样。
中国预防医学科学院微生物研究所利用胶体金技术、双抗体夹心法和显色反应等特点，研制了大肠杆菌O157:
H7病原体快检金卡，通用于定性检测粪便、食品、水等样品中的O157:
H7大肠杆菌。
显色程度与样品中细菌含量成正比，最低测菌量为少于100个菌细胞，主要特点是敏感性高，可用于待检样品初筛，阳性样品可进行细菌分离，减少工作量。
H7的常用检测方法是粪便培养后作细菌分离,然后用生物化学和免疫学方法鉴定,一般需72小时。
Dylla等用一种快速ELISA直接检测粪便中大肠杆菌O157:
H7,并与标准培养方法加以对照。
结果显示,ELISA检测183份粪便标本,检出大肠杆菌O157:
H79份。
常规培养法阴性176份,而ELISA阴性174份。
总特异性为98.9%。
该法与其它非O157:
H7大肠杆菌无交叉反应,是一种准确、敏感、特异、易观察结果的筛选方法，尤其适用于中、小实验室及大量粪便标本的流行病学调查。
Padhye等用单克隆抗体进行直接ELISA反应检测O157:
H7,除O26：
H11外，未发现与沙门氏菌、结肠炎耶氏森菌、志贺氏菌和肺炎克雷伯民菌等有交叉反应。
单克隆抗体用于检测大肠杆菌O157:
H7有明显特异性，可作为一种免疫试剂用于临床和食物标本的快速检测。
Clark等近一步对单克隆抗体的研究发现,此种单克隆抗体识别的物质是LPS,这种LPS抗原决定簇用全细胞ELISA同样可以在其它血清型大肠杆菌和产生或不产生Vero毒素的大肠杆菌中检测到,而且易受到胆盐、吖啶黄和温度的影响,但可以通过结合免疫捕获的修饰方案来提高ELISA的特异性。
DEFT与Ab-DEFT：
直接荧光技术（DEFT）与抗体定位荧光技术（Ab－DEFT）的主要特点是,显微镜下直接计数样品菌细胞。
由于无需培养或分离过程,因此检测非常快速。
DEFT的基本原理为:
对样品进行过滤,用荧光染料（如吖啶橙）对留在滤膜上的菌细胞染色后,用荧光显微镜观察计数。
但由于荧光染料的非特异染色,不但被检菌被染色,本底杂菌也可染色,从而影响了结果的精确性。
Ab-DEFT则克服了这一缺点,过滤后的菌细胞与荧光标记的特异抗体作用,然后用荧光显微镜观察计数。
固相荧光毛细管免疫分析
此方法高度敏感，具有快速、试剂用量少、易于操作等优点。
Czajlu等用热杀死的O157:
H7菌包被玻璃毛细管作固形支持物。
样品中加入结合了生物素的O157:
H7多克隆抗体,作用一段时间,然后将此样品/抗体混合物与标记了Cy5（一种荧光花青染料）的亲和素加入到毛细管,孵育2min,冲洗、吹干,由激光传感器系统发射650nm波长激发光激发花青染料,之后用光学传感器系统测定荧光发射密度。
直接免疫荧光抗体染色
Park等对粪便样品进行离心后,用免疫荧光抗体对粪便涂片进行标记,可检测到所有培养法证实的菌株,检测时间<
2h。
该方法是以胶乳颗粒作载体,以O157:
H7特异性抗体致敏,制成特异的胶乳试剂,将标本乳化于玻片或有色烧盘上，滴加胶乳试剂,呈明显凝集而对照胶乳不凝集时即为阳性。
6．间接血凝分析（IEHA）
该法多用于对LPS、可溶性本体抗原、未加热抗原的抗体检测,对检测H抗原的抗体效果不佳。
Morooka等检测了溶血性尿毒综合征（HUS）病人血清LPS抗体,虽然甲醛化羊红细胞（SRBC）有低水平非特异性吸附,但不影响该方法作为一种有效、快速（<
3h）的诊断方法。
因为感染病人血清的滴度明显高于非特异性吸附。
VIDAS是一种全自动抗原抗体检测系统。
可直接从感染性疾病患者标本中检测细菌、病毒、弓形虫、衣原体和螺旋体等微生物的抗原、抗体或毒素。
基本原理：
采用酶联免疫（夹心法）原理，并在底物中掺入荧光物质，最终产生荧光产物4-甲基-7-羟刀豆素，荧光强弱与标本中被测物浓度相关，经扫描样本读数与标准比较计算出标准值，并根据阴性和阳性临界值判定结果。
8.免疫印记法
目的是检测大肠杆菌O157:
H7感染者血清中的O157脂多糖和溶血素特异性抗体。
基本原理是将提纯的脂多糖或溶血素用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，通过转移电泳转移到硝酸纤维膜上，然后用抗原抗体进行免疫检测。
包括SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转移电泳、免疫检测三部分。
特点是具有比较高的特异性和敏感性。
免疫检测
将封闭好的硝酸纤维素膜按梳子齿的宽度剪成每一个泳道一条，依次编号。
1）每条加入1毫升用PBS稀释的病人血清，室温震荡2小时，同时设阳性对照和阴性对照；
2）用2.5毫升／条PBST震荡洗涤3次，每次5分钟；
3）加入用1毫升用PBS稀释的II抗，室温震荡1小时；
4）用2.5毫升／条PBST震荡洗涤2次，每次5分钟，再用PBS洗涤一次；
5）将膜放入12毫升显色液中显色，室温震荡15-30分钟，至阳性对照出现满意的蓝紫色；
6）将膜放入蒸馏水中终止显色反应，照相；
7）当显色的条带和溶血素的分子量或0157脂多糖的条谱一致时，结果判断为阳性。
二．分子生物学检测
分子生物学的出现，为更快诊断微生物提供了许多分子学工具。
这一新的研究是用基因型而不是表型因子来鉴定特异性病原体。
因此其特异性更好。
加之操作程序自动化使得DNA分析在实验室应用中已成为常规操作。
自动化DNA提取仪，聚合酶链式反应仪（PCR仪），DNA序列分析仪，脉冲凝胶电泳仪（用于分离DNA大片段，如完整的染色体）在疾病诊断中都是很有用的。
1．DNA探针
探针（probe）标记：
放射性核素、非放射性物质标记。
探针的来源：
①克隆的基因组DNA探针；
②cDNA探针；
⑧RNA探针；
④寡核苷酸探针。
标本处理：
根据标本来源和量的不同而处理不同。
杂交方法：
斑点杂交、southern印迹、原位杂交、Northern印迹等。
杂交信号检测：
（1）测量放射性核素射线脉冲数
（2）放射自显影（3）显色法（4）发光法。
O157:
H7特异噬菌体上的sltⅠ、Ⅱ基因、大质粒溶血素基因及染色体上eae基因等都已制成了可杂交检测的特异探针。
Beutin等曾用VT1（750bp,）、VT2（850bp）、溶血素（3.4kb）等探针进行流行病学调查。
Thomas等用地高辛标记的VT2B亚单位基因、VT2C基因探针检测不同噬菌体型O157:
H7菌。
Huck等筛选了O157:
H7大质粒上限制性片段,发展了一种2.0kb的SmaI片段探针,认为此探针对O157:
H7血清型最为特异,可与所有O157:
H7试验菌杂交。
2.PCR技术
聚合酶链式反应技术（PCR）是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法。
具有特异性强、敏感性高、快速、简便、可扩增RNA或cDNA、对起始材料质量要求低等优点。
PCR技术扩增体系的基本成分
引物:
PCR产物的特异性主要取决于引物链的特异性。
由于存在同源序列，随意设计的引物链，其PCR产物在电泳分析时可能出现多条链，因此在设计引物链时应充分考虑引物特异性。
引物长度一般为15-30个碱基,G+C含量为40-60%,浓度0.1-1umol/L。
TaqDNA聚合酶：
浓度为1-4ul/100ul。
TaqDNA聚合酶单位用量增长可能导致非特异DNA扩增。
模板DNA：
应避免混有任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂及能结合DNA的蛋白酶。
DNA摸板的制备方法有加热法、冻溶法、超声波粉碎法、碱变性法、SDS裂解法等多种。
4×
dNTPs：
dNTP储存液pH应为7.0，在反应体系中，4种dNTP的浓度应相同，每种dNTP的浓度以50-200umol/L为宜。
缓冲液及其他成份：
PCR反应体系中，一般采用Tris-HCl缓冲液。
适宜的Mg2+浓度为高于dNTP总浓度0.2-2.5mmol/L。
PCR技术循环参数
PCR扩增是由变性、退火和延伸三个步骤反复循环而实现的。
确定正确的循环参数是PCR成功的保证。
循环参数
1．变性温度和时间
模板DNA和PCR产物的变性不完全，是PCR反应失败最常见的一个原因,在变性步骤，使温度达到双链DNA完全分离的变性条件是95℃，30s。
对GC含量高的靶DNA序列，宜用较高的变性温度。
在解链温度下，DNA的变性仅需几秒。
但是，使反应管内达到解链温度需要一定的时间。
原则上变性步骤应高温、短时，即要保证变性充分，又要保持聚合酶在整个反应中的活性。
2．引物退火
引物退火的温度和时间取决于引物的长度、碱基组成及其在反应体系中的浓度。
对GC含量约50％，长20个碱基的典型寡核苷酸引物而言，最佳的退火温度为55℃。
在温度较高的条件下退火，可提高PCR的特异性。
3．引物延伸：
引物延伸是DNA聚合酶将脱氧单核苷酸逐一地加到引物的3’一OH末端，引物延伸温度取决于DNA聚合酶的最适温度。
如用TaqDNA聚合酶，一般取70-75℃，常用72℃。
延伸步骤的时间则取决于目标序列的长度、浓度和延伸温度。
目标序列越长、浓度越低、延伸温度越低，则所需的延伸时间越长；
反之，目标序列越短、浓度越高、延伸温度越高，所需的延伸时间则越短一般而言，每1000个碱基的序列，延伸时间1分钟便足够了。
对于扩增100—300个碱基的短序列片段，可省去延伸温度这一步骤，而采用快速简便的变性、退火双温循环。
这是因为TaqDNA聚合酶即使在退火温度下仍保持很强的活性，而延伸过程可在退火温度转变为变性温度的过程中完成。
扩增产物长度100bp500bp1000bp2000bp
94℃变性时间（秒）30306060
55℃复性时间（秒）30306060
72℃延伸时间（秒）3038120180
一般作25-30个循环即可，进行最后一次循环时间、延伸时间增加5分钟。
PCR扩增产物的检测方法
PCR反应混合物经过循环扩增后，所需做的工作就是检测反应液中是否存在预期扩增产物及产物的特异性。
目前已经发展了许多检测分析PCR扩增产物的方法。
包括凝胶电泳、高压液相色谱、核酸探针杂交、探针捕获酶免疫分析、酶切图谱分析、单链构型多态性分析、核酸序列分析。
PCR技术类型
免疫PCR技术原位PCR技术不对称PCR技术
巢式PCR技术反向PCR技术逆转录PCR技术
复合PCR技术彩色PCR技术抗原捕获PCR技术
增敏PCR技术酶标PCR技术二温式PCR技术
锚定PCR技术定量PCR技术毛细管PCR技术
多重PCR技术巢式或套式PCR技术
PCR技术在大肠杆菌O157:
H7检测中的应用
（1）简单PCR：
Meng等以eae基因5′末端附近一段688bpDNA片段为基础设计了一对引物,扩增产物为633bp的DNA片段。
其退火温度为60℃－63℃,应用煮沸法与基因释放法,大肠杆菌O157:
H7检出限分别为25与38CFU/ml,检测时间为3h。
Thomas等用PCR扩增了slt基因片段。
引物：
正链5′-（TTTACGATAGACTTCTCGAC）-3'
反链5′-（CACATATAAATTATTTCGCTC）-3’
其PCR产物由凝胶电泳测定,检测时间为ld。
徐建国等根据O157:
H7特有的hlyA、B基因序列设计了PCR引物,产物为338bp。
（2）多重PCR:
由于鉴定O157:
H7血清型不能仅仅依靠简单PCR,近年来国外学者对多重PCR方法在大肠杆菌O157:
H7的诊断价值方面进行了研究。
Meng等同时扩增了eae上游基因片段、sitⅠ基因片段、sitⅡ基因片段,其长度分别为633、210、484bp。
此引物设计可有效区别O157:
H7血清型与O55:
H7、O55:
NM。
Fratamico等在一个单一反应中同时扩增了eae基因、sltⅠ、Ⅱ的保守序列及60MDa质粒保守序列,其产物分别为1087、227、224、166bp。
严笠选用针对大肠杆菌O157:
H7志贺样毒素Ⅰ、Ⅱ（SLT－Ⅰ、SLT－Ⅱ）和溶血素（Hly）基因的三对引物,在同一扩增体系中进行PCR,检测12株不同来源的O157:
H7大肠杆菌及其它致病性大肠
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