植物生殖工程Word文档下载推荐.docx
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即器官、细胞和原生质体水平。
器官操作包括花药培养、子房培养和胚珠培养、胚和胚乳培养、试管受精等。
细胞操作主要是指花粉和胚囊的分离和培养；
原生质体操作是指由四分体或胚囊细胞分离而获得原生质体并进行培养；
受精工程即离体的精卵细胞的融合和培养。
二、植物生殖工程研究简介
1.离体器官操作
（1）试管授粉试管授粉或试管受精是指为了克服交配的不亲和性，离体培养子房或胚珠而在试管中完成受精过程。
这种技术已较广泛地应用于克服远缘杂交或自交不亲和性。
（2）子房和胚珠培养它包括受精或未受精子房和胚珠培养。
受精子房和胚珠培养的目的也是在于克服杂交或自交胚的败育，详见第六章。
未受精子房和胚珠培养既是诱导卵器细胞形成单倍体植株进行单倍体育种的途径，又是研究人工诱导无融合生殖和实验生殖生物学的好方法，下一节中将予以详细介绍。
（3）胚和胚乳培养胚培养是克服远缘杂交困难经常采用的方法（见第七章）。
胚乳是极核受精的产物，一般多为3n。
因此进行胚乳培养的目的之一，在于培养三倍体植株以获得无籽的瓜果，如无籽西瓜、无籽柑桔和无籽枇杷等。
（4）花药培养离体培养花药是大量获得单倍体进行单倍体育种和遗传学研究的重要技术，也是研究雄核发育（androgensis）等生殖生物学问题的良好方法。
（5）再生雄蕊和花粉的研究离体再生雄蕊和花粉对于研究整个雄性系统的发育和调控具有十分重要的意义。
该项研究首先由陆文梁（1988）在风信子上获得成功。
2.离体细胞的操作
（1）大孢子母细胞、大抱子和胚囊的分离大孢子母细胞、大孢子和胚囊被子房壁、珠被、珠心组织所包裹，长期以来不能直接研究和利用。
自从70年代前苏联学者用酶法分离烟草、列当活胚囊以后，周嫦和杨弘远（1982、1984），胡适宜等（1985）改进技术方法，采用酶解、振荡分离纯化技术或压片技术获得固定的或生活的大孢子母细胞、大孢子和胚囊。
在烟草、泡桐、芝麻、颠茄、金鱼草等植物中获得成功，为直接研究这些细胞和进行遗传操作奠定了基础。
（2）花粉培养花粉培养是吸收花药培养的经验，直接培养游离花粉。
花粉培养的优点是：
①可以直接观察研究培养条件下花粉细胞的发育、脱分化与再分化过程。
②体细胞组织来源的愈伤组织或胚状体形成的植株及混倍体的频率均可大幅度降低。
③可以减少体细胞对花粉细胞发育的竞争和抑制作用，提高花粉诱导频率和成苗率。
因此花粉培养代表着单倍体育种的发展趋势。
花粉培养已在烟草、油菜、水稻等作物中获得成功。
3.性细胞原生质体的分离与培养
它包括卵及其他胚囊分子的分离、花粉原生质体的分离与培养、生殖细胞与精细胞的分离与培养、配子-体细胞融合的研究、受精工程的尝试等等。
卵及其它胚囊分子一般是单倍体，由于它们在受精前后阶段呈部分无壁的天然原生质体状态，加上酶解的分离作用，因此获得的原生质体对于开展生殖工程研究具有十分重要的意义（胡适宜，1986）。
虽然在分离活胚囊之后辅以压片技术已能获得烟草、颠茄的卵及其胚囊分子的原生质体（胡适宜等，1985；
李乐工和胡适宜，1986），但是，由于胚囊细胞深藏在胚珠内部，一个胚珠又仅含一个胚囊，如何大批量地获得和收集纯净的胚囊及胚囊中的细胞的关键技术尚未突破。
因此，该技术仍处于探索阶段。
对于雄性细胞的操作，花粉原生质体、生殖细胞和精细胞的分离和培养，在80年代中后期，已形成一个新的研究热点。
目前已从几十种植物中分离出花粉原生质体、生殖细胞和精细胞；
利用配子一体细胞融合技术已从矮牵牛、烟草等植物中获得花粉原生质体与体细胞原生质体融合的三倍体植株；
利用分离的精子和卵进行确切意义上受精工程的尝试也已经开始（Kranz，1990，1991），已从受精工程形成的合子诱导发育至愈伤组织并分化出根。
人们正期待着受精工程植株再生成功。
第二节未受精子房和胚珠培养
一、概况
SanNoeum（1976，1979）首次利用大麦未受精子房培养出单倍体植株，并采用“离体雌核发育”（invitrogynogenesis）的术语来说明在离体条件下未受精胚囊细胞产生单倍体植株的现象。
该项研究成功的意义在于开辟了单倍体育种的另一途径，这对于花粉培养尚未获成功的物种尤为重要，并且为实验生殖细胞学，特别是雌核发育的研究建立了良好体系，同时为开展植物的遗传工程提供了新的受体（蔡得田和陈冬玲，1986）。
经过十几年的研究，目前未受精子房和胚珠培养成功的植物已达7个科19个种（表8．1）。
研究较多地集中在禾本科、茄科及菊科，占全部再生植株物种的2／3，尤以禾本科植物研究最多，占全部种的1／3。
周嫦和杨弘远（1982）对影响未受精子房和胚珠培养的因素、雌核发育胚胎学、胚囊植株的细胞遗传学曾作过综述。
在水稻（周嫦1983）、向日葵（阎华等1985）、非洲菊中已分别建立起可重复的培养流程。
二、未受精子房和胚珠培养的技术
未受精子房和胚珠培养的技术因物种不同而有所差异，但均包括以下基本技术程序：
①选择合适的基因型材料；
②确定合适的接种期；
③选择合适的培养基；
④采用一定的接种方式，如固体培养、液体漂浮培养、平放或直插等；
⑤保温培养；
⑥染色体鉴定；
⑦染色体加倍；
⑧胚囊植株及其后代观察。
这里仅就①②两项的方法予以介绍。
1.材料的基因型
在未受精水稻子房培养中，胚囊愈伤组织的诱导频率依野生稻、籼稻、粳稻的次序而增加（周嫦等，1982；
蔡得田，1984；
蔡得田等，1988）。
在同一类型的水稻中，不同的品种具有不同的诱导频率。
如周嫦等试验了19个品种，其中15个粳稻品种全都诱导出胚囊愈伤组织，诱导频率变幅为1.5-2.0％；
而在籼稻的4个品种中，2个未能诱导出愈伤组织，2个品种的诱导率也较低，分别为1.19％和2.8％。
蔡得田试验的5个种的野生稻中仅从一个种的野生稻子房里诱导出愈伤组织，但未分化出苗；
但培养具有无融合生殖特性的多胚水稻时，2个粳稻和2个籼稻品种都诱导出胚囊愈伤组织（蔡得田等，1991）。
这种现象是否与无融合生殖特性有关值得考虑。
2.接种时期
一般以花粉发育时期为接种子房或胚珠的参照时期。
确定接种时的胚囊发育时期很重要，对诱导结果有明显影响。
目前培养成功的植物大多接种处于胚囊单核至近成熟时期的材料（SanNoeum，1979；
周嫦和杨弘远，1981；
郭仲琛，1982；
吴伯骥和郑国锠，1982；
黄群飞等，1982；
Truong-Andre和Demarly，1984；
阎华等，1985；
Bornman，1985；
蔡得田等，1988；
1991），而接种大孢子发生时期的子房（周嫦和杨弘远，1981；
黄群飞等，1982）或过于幼嫩的子房（敖光明等，1982）时，难以诱导雌核发育。
尽管在烟草、黄花烟草和在大卫百合（Liliumdavidii）等植物中在大孢子发生阶段接种，仍有部分雌核发育始于近成熟的胚囊。
特别是周嫦等（1982，1983）观察到接种大孢子时期的水稻子房，要在离体条件下发育到胚囊细胞形成以后才启动雌核发育，而不是由大孢子直接启动胚胎发生。
若接种胚囊完全成熟的材料，虽然可被诱导，但频率很低，而且发育前途不大（李国民和杨弘远，1986）。
接种近成熟胚囊时期的材料较易诱导成功，这在向日葵的子房和胚珠培养中得到证实（蔡得田和周嫦，1983；
阎华等，1985）。
玉米的成熟子房不仅比幼嫩子房利于诱导单倍体，还可不经愈伤组织直接出苗（敖光明等，1982），因此认为接种时期是比选择培养基更重要的因素。
三、胚囊植株的起源
从现有的雌核发育胚胎学研究看，胚囊植株的起源主要有四种类型：
①卵细胞孤雌生殖为主。
甜菜、向日葵（阎华等，1985）是这种类型的代表：
它们的雌核发育起源于卵细胞。
此外在大麦（黄群飞等，1982）、青稞（谷祝平与郑国锠，1984）和玉米中，除了以卵细胞孤雌生殖为主外，还有反足细胞的无配子生殖，但这种无配子生殖的前途如何尚未确定。
②助细胞的无配子生殖。
据田惠桥与杨弘远（1984）观察，水稻助细胞的无配子生殖是原胚的主要来源；
反足细胞偶尔亦可分裂成类似原胚的结构，但卵细胞仅能进行异常的游离核分裂，出现一种衰退的趋势。
这种助细胞的无配子生殖较稳定，不因条件的变化而改变（何才平与杨弘远，1988），似乎说明这种无配子生殖方式受遗传因子决定。
③反足细胞无配子生殖。
田惠桥和杨弘远（1989）在韭菜（Alliumtuberosum）中观察到以反足细胞起源为主的雌核发育，而且能够培养出完整小植株。
④其他类型。
在烟草和黄花烟草中，单倍体既可来自成熟卵细胞，又可来自大孢子（吴伯骥与郑国锠，1982；
祝仲纯等，1984）。
谷祝平与郑国铝（1983）认为大卫百合是由大孢子直接进行雌核发育的。
但是周嫦和杨弘远（1980）曾观察到接种处于大孢子发育阶段的水稻子房需要继续发育到胚囊细胞形成后才启动雌核发育。
看来，直接起源于大孢子的雌核发育值得深入研究。
四、胚囊植株当代及后代的遗传表现
刘中来与周嫦（1984）比较了同一品种在相同培养条件下产生的胚囊植株与花粉植株类型。
胚囊植株中的单倍体比例较高，二倍体比例较低，混倍体较少。
而且胚囊植株绿苗率高（可达89.3%），白化苗率低（8.8％），与花粉植株白化苗率高的特点呈鲜明的对比，构成子房培养的一个十分突出，而且十分有意义的特点。
尽管胚囊植株当代及二代株系的形态性状和结实性与二倍体花粉植株及原始品种相似，各株系内的植株亦基本整齐一致，但在胚囊植株中也曾出现过不育株的变异。
研究其花粉母细胞减数分裂的染色体行为，在中期I发现67．5％的细胞中具数目不等的单倍体。
在大卫百合的胚囊植株中也发现2／3的二倍体和1／3的单倍体两种类型（谷祝平与郑国锠，1983）。
向日葵子房培养则出现混倍及二倍体占优势的胚囊植株群体（Gelebart和San，1987）。
在小麦（严健汉等，1979）、水稻（蔡得田等，1991）等禾本科作物中同样发现胚囊植株有白化苗的存在。
在非洲菊中，有报道认为胚囊植株较花粉植株更整齐一致，更健壮（Sitbon，1981）。
五、胚囊——植物遗传工程的受体
胚囊作为植物遗传工程受体的优点是：
①胚囊内的卵细胞、助细胞和中央细胞在子房成熟时期呈现部分无壁的状态。
这种天然原生质体状态与酶分离的原生质体相比较，无壁状态持续时间长，没有酶造成的损伤。
②单倍体。
胚囊细胞由单倍体组成，有利于外源基因的引入和表现，不易出现嵌合体。
③世代交替的转折期与再生潜能。
卵细胞正是配子体世代向孢子体世代的转折期，与花粉单核靠边期由孢子向配子体转折相类似，可能具有一定的生理生化特性，易于诱导培养，因此卵细胞具有很强的再生潜能。
虽然一般未受精子房或胚珠培养的诱导率为5-10％，与花粉培养比较相对较低，但每个胚珠只有一个胚囊，胚囊中只有一个卵细胞，所以从细胞水平比较，卵细胞的再生率是高的。
④胚囊体积大，胚囊壁结构特殊。
许多植物胚囊壁由角蛋白或胼胝质组成，有利于遗传操作（蔡得田与陈冬玲，1986）。
可能正是基于这样的特点，周光宇等（1983）对受精前后的棉花子房进行DNA微注射引入外源基因选育出了抗枯萎病的棉花品系；
罗忠训等（1986）利用水稻未受精子房培养和微注射技术引入玉米醇溶蛋白基因；
范云六、吴瑞等同样是利用受精前后子房内的胚囊细胞的特点和花粉通道技术引入外源基因获得转基因植株。
第三节花药和花粉培养
一、花药和花粉培养的重要意义
花药和花粉培养是人工获得单倍体的重要途径。
人工获得单倍体的途径有四种：
①花药和花粉培养；
②未受精子房和胚珠培养；
③染色体消除；
④半配受精。
其中以花药和花粉培养最易大批量地获得单倍体，并且从花药或花粉获得的单倍体植株可斟经自发或诱发染色体加倍而形成纯合二倍体，因此应用得最为广泛。
此外，花药内花粉数量多，本身为单倍体细胞，离散性好，发育同步性高，因此在遗传操作中具重要作用。
花药培养的简史与现状可参见第四章，本章不再赘述。
二、花药培养的基本技术和影响因素
花药培养的基本程序包括：
①挑选适宜的基因型作材料；
②确定花粉发育时期；
③材料的预处理；
④诱导培养；
⑤分化培养；
⑥染色体数观察和染色体数加倍；
⑦花粉植株当代及后代观察鉴定。
影响花药培养的因素很多，如材料生理状况和基因型、接种时期、接种方式（如直插、或平放）、培养方式（固体、漂浮、液体浅层连续培养、条件培养等）、培养基（H、N6、C17、B5、禾谷类通用培养基等）、激素、密度效应与条件培养等等。
现仅就材料基因型和材料预处理加以阐述。
1.材料基因型
材料基因型的选择是花药培养中的重要措施。
从目前培养成、功的植物种来看，茄科、禾本科、十字花科的植物所占比例较大。
花药培养首先在茄科植物毛叶曼陀罗（Guha和Maheshwari，1964；
1966）获得成功。
在水稻中已从各种类型栽培稻、野生稻的花药培养出单倍体植株（蔡得田等，1991）。
水稻的花药愈伤组织诱导率按粳稻、籼稻、野生稻的顺序依次降低，但分化白化苗出现的频率则恰恰相反。
此外不同物种的花粉愈伤组织诱导频率不一样，如蔡得田发现尼瓦拉野生稻诱导频率高达23.1％，而药用野生稻诱导频率为零。
烟草、大麦等不同品种对花粉愈伤组织诱导亦有不同反应（Devaux，1992）。
少数具有高度雄核发育能力的玉米基因型已被选育出来，玉米花药可培养性已被联系到一套RFLP标记，并与已知染色体位置相关（Petolino，1992）。
2.材料的预处理
材料的预处理指的是在花药接种之前，将离体的花蕾或连同花序一起在一定的条件下经过一段时间处理后接种，这样往往司以提高花粉愈伤组织诱导频率。
预处理有三种主要方法：
①低温预处理；
②离心处理；
③高温预处理或预培养。
一般情况下，接种花药的花粉多处于单核中、晚期。
此时花粉（即小孢子）从形态结构上表现极化，即细胞中存在较大的液泡，核处于花粉的一端，正是孢子体向配子体转折的时期。
小孢子需要从生理生化特点上准备进行一次重要的细胞分裂（大多数为不均等分裂）。
因此采用低温、离心预处理的目的，就是从形态上改变其极性分布，从生理生化上改变其细胞生理状态，以改变其分裂方式和发育前途。
实践证明低温预处理显著地提高了诱导频率（Maheshwari等，1982），甚至可以直接诱导孢子体途径。
离心的作用主要在于使花粉的极性分布受到破坏，从而有利于诱导孢子体发育。
关于低温预处理的机制有几种可能：
①低温条件改变了小孢子第一次有丝分裂的轴向，纺锤体的改变导致花粉沿孢子体途径发育。
②低温预处理使小孢子处于低代谢状态，延长了小孢子的生活力，从而提高了诱导频率。
③低温预处理可能耗尽花粉中贮藏的物质，致使花粉向配子体途径发展时缺乏原有的物质基础，此时外界因素的诱导有可能使之转向孢子体途径。
最后一点在亚微水平研究中得到证实。
花粉培养中，花粉胚胎发生的胞质特征是：
贮藏物质稀少，细胞器数量少，核糖体密度低，整个细胞质电子密度较低。
低温预处理使花粉粒中与辅酶A连接的糖基连结物发生明显的改变，而这些改变与胚胎发生的诱导密切相关。
对于高温预处理的作用机制，Dunwell等（1983，1985）的解释是：
①高温破坏了药壁与小孢子间的发育联系。
②高温对大多数小孢子是致死的，这样可以减少成活小孢子的数目，减少它们之间的竞争。
③高温使小孢子发育同步化，增加了处于发育周期中诱导敏感阶段的小孢子数。
④高温损害非单倍体组织，可以促进单倍体胚的生长。
此外，高温处理还引起热刺激蛋白发生，似乎表明钙调蛋白亦起一定作用（Pechan，1991）。
三、雄核发育途径、饥饿与花粉二型性
雄核发育的途径是根据花药（粉）培养中花粉起始分裂的形式，以及分裂后的细胞在形成花粉胚状体或愈伤组织中的作用而划分。
其主要类型有：
①营养细胞发育；
②小孢子发育；
③营养核、生殖核共同发育；
④生殖核发育；
⑤其他发育类型，如游离核型。
花粉的二型性（pollendimorphism）指同一花药中存在两类不同的花粉。
一类为正常花粉，它们的细胞质较浓，发育较一致，染色较深；
另一类为异常花粉，这类花粉较小，它们的细胞质较淡、染色较浅，发育落后（Dunwell，1992）。
Sunderland等在研究花药培养的发育途径中发现后一类花粉具有雄核发育能力，形成花粉胚，因此特称为胚性花粉或E花粉（embryonicpollen）。
他们从曼陀罗、烟草等植物中观察到花药（粉）培养诱导率与这种E花粉的多少有关，因此认为选择材料的基因型亦即选择E花粉多的材料，是花药和花粉培养的关键。
这种雄核发育与花粉二型性相关的想法在大麦等花药培养中得到一定的验证。
但是在一些花粉二型性不明显，而诱导频率较高的植物中，以及象油菜花药培养诱导频率低，而改进后的花粉培养诱导率大为提高的情况下，花粉二型性的解释则值得商榷了。
最近应用细胞学、生物化学和分子生物学分析方法对小孢子胚胎发生机制进行研究，获得了极其重要的进展（Dunwell，1992）。
Bhojwani等（1973）在烟草花药培养中发现，胚胎发生的小孢子的蛋白质和RNA含量仅及无胚胎发生的花粉粒的六分之一。
某些物质的亏缺即“饥饿”被看作是胚胎发生启动的重要条件。
Benito等（1988）认为在蔗糖饥饿情况下，诱导启动时培养基中与之有关的组成物是蔗糖。
Kyo和Harada（1985，1986）把高度纯合的二核中期花粉培养在含有谷酰胺的基本培养基中，大多数花粉发育成正常的成熟花粉。
如果将花粉首先培养在无谷酰胺的培养基中，它们的细胞质则发生退化（Bhojwani等，1973）；
当将这些花粉转入具有谷酰胺和蔗糖培养基中时，细胞分裂出现。
对于这种谷酰胺“饥饿”时期诱导启动事件进行生化标记研究，发现了一系列特异磷蛋白（Kyo和Harada，1990a．b；
Kyo和Ohkawa，1991）。
进一步深入研究发现，淀粉合成酶基因和一种尚未鉴定的cDNA克隆NTPC303基因是发生在花粉胚胎发生诱导期间的潜在有用的标记。
Vicente等（1992）在研究饥饿时期蛋白质和RNA类型时，也发现两种诱导产生的特异mRNA。
对花粉的营养细胞进行细胞周期研究发现，正常的花粉发育过程中，营养核保持或接近于GI期的1CDNA水平。
而在饥饿情况下，诱导发生了部分花粉的营养核DNA合成，这表明饥饿诱使营养核通过了一个细胞周期控制点。
这个控制点可能是在GI后期，在酵母中称为START。
这种类似于酵母中的cdc10+基因的功能可望得到分析研究。
在油菜小孢子培养诱导启动研究中，Hamaoka等（1991）发现，油菜的花粉如同烟草一样，仅仅由营养核参与胚形成，花粉的被诱导启动时间严格限制在8小时以内。
Peehan等（1991）研究诱导花粉的mRNA和蛋白质类型，在32℃情况下培养4小时，发现了一些编码高分子量的蛋白质的基因转录物；
双向电泳分析证明一些18、19、20和69kD的蛋白质是小孢子胚胎发生的相关物。
这说明热刺激蛋白确实与小孢子细胞的增殖有关。
四、花粉培养
花粉培养是以游离花粉粒进行直接培养的技术。
由于没有药壁的哺育作用，游离花粉培养往往较花药培养困难，起初的诱导频率也很低。
以后由于技术的改进，注意处理花药因子与预培养的关系，将花药预培养后再作游离花粉培养，大大地提高了诱导率。
花药预培养在早期游离花粉粒培养中起重要作用。
小孢子的启动发育离不开花药，药壁组织对小孢子的启动发育可能提供重要的促进物质，称为花药因子。
钟华鑫和梁海曼（1981）认为这种作用至少涉及两个方面：
①在花粉去分化中药壁组织向花粉提供了必要的营养物质。
②药壁组织吸收、贮存和转化培养基中的外源物质，起着花粉代谢库的作用。
改进花粉培养的技术之一是采用液体浅层连续培养方法，把花粉的预培养与花粉的启动分裂和自由离散特性联系在一起。
陈之征与陈正华诱导了油菜花粉胚状体。
Keller，采用32－34℃高温预培养大大地提高了花粉培养的效果。
Chuong和Beversdorf（1985）在油菜游离花粉培养中也获得重大进展，在一定条件下高频率地诱导出胚状体，最高使每个花药的花粉形成54个胚状体。
他们成功的关键在于：
①将适期花药的花粉离散出来，培养在22－32℃条件下：
其中以先在32℃下培养三天，然后转入25℃下培养3－4星期的处理效果最好，诱导产生胚状体的总数较对照高出500－800％。
②用13％蔗糖改良Nitsch培养基加入1mg／LNAA和0.5mg／LBA进行诱导培养。
由于油菜游离花粉培养的诱导频率远远高于一般花药培养的频率，已能应用于油菜育种实践；
利用花粉离散性好的优点，进行诱变筛选和胚胎发生启动机理等方面的研究，也远较花药培养方便。
五、花粉植株的遗传研究
花药培养产生的花粉植株常出现染色体数和染色体倍数性的各仲变异类型。
高等植物的单倍体（haploid）是指具有配子体染色体数目的孢子体。
由二倍体植物的花药（粉）培养获得的单倍体只含有一个染色体组，称为一倍体（monoploid）。
而由多倍体产生的单倍体花粉植株，虽然其体细胞的染色体数是正常植株体细胞染色体数的一半，但仍含有多个染色体组。
1974年在加拿大召开的“高等植物单倍体第一次国际讨论会”上通过了以下名词术语。
整单倍体（euhaploid）、一倍体（monohaploid，由二倍体衍生），多元单倍体（polyhaploid），非整倍单倍体（aneuhaploid）、二体单倍体（disomichaploid，n+1），附加单倍体（additionhaploid，n+1，n+2等），缺体单倍体（nullisomichaploid，n-1），代换单倍体（substitutionhaploid，n-1+1），错分裂单倍体（misdivisionhaploid）。
由于花粉植株既是孢子体又是单倍体，并可由不同染色体组构成，因此描写花粉植株的染色体数公式则与正常的二倍体植株不同。
例如水稻花粉植株染色体数公式为2n＝x＝12；
小麦花粉植株染色
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