土壤及灌溉水二氯喹啉酸除草剂残留量的测定高效液相色Word格式.docx
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适用作物为水稻（包括水稻秧田、直播田、移栽田和抛秧田），对2叶期以后的水稻安全。
主要用于稻田防除稗草，也可防治雨久花、田菁、水芹、鸭舌草等农田杂草。
在使用过程中发现，许多农作物对二氯喹啉酸敏感，包括番茄、烟草、马铃薯、茄子、辣椒、胡萝卜、芹菜、菠菜、甜菜、棉花、黄瓜、甜瓜、西瓜、南瓜、青豆、紫花苜蓿、向日葵、甘薯等。
当土壤和灌溉水中残留一定量的二氯喹啉酸时，就会造成药害，导致这些作物畸形生长。
1998年至2002年期间，广东省烟区出现因水稻田施用二氯喹啉酸，而引发后茬烟草大面积的生长畸形，给当地烟农带来了巨大的经济损失。
2011年湖南部分烟区也出现完全相同于广东烟区烟草生长畸形发生，受害几百亩，经项目组检测也是由土壤残留二氯喹啉酸引起。
据报道，我国烟草种植面积为1600万亩左右。
我国烟区主要分布于南方，约占植烟总面积的94%。
烟区种植模式主要有：
旱地以烟草与玉米（或其它作物）轮作，水田以烟草与水稻轮作；
而南方烟区以烟草与水稻轮作为主，约占南方烟区的50%左右。
为了避免南方50%左右烟区因环境中残留二氯喹啉酸而导致烟草和其它作物生长畸形再度发生，需建立一种快速检测土壤及灌溉水中二氯喹啉酸残留量的标准方法。
为了配合建立此标准方法，项目组从全国不同烟区采集的土壤和灌溉水样品中，分析了不同土壤类型、不同pH和灌溉水对二氯喹啉酸降解动态的影响，为我国烟草安全性生产和环境治理提供科学依据和技术保障。
关键词：
二氯喹啉酸、土壤、灌溉水、残留、高效液相色谱分析、标准方法
2.标准的适用范围
本标准规定了土壤及灌溉水中二氯喹啉酸除草剂残留量的测定方法——高效液相色谱法。
本标准适用于土壤及灌溉水中二氯喹啉酸残留量的测定。
3.原理
3.1测定方法原理
以甲醇和1%乙酸水溶液为流动相，采用填有粒径5µ
m的高效固定相的柱色谱分离技术。
精确吸取10μL样品注入高效液相色谱仪进行色谱分离，用紫外吸收检测器，于240nm波长处检测二氯喹啉酸的吸收值。
采用外标法，根据吸收峰面积计算其含量。
3.2二极管阵列检测器原理
二极管阵列检测器（Diode-arraydetector,DAD）：
以光电二极管阵列作为检测元件的UV-VIS检测器。
可构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式接受器上的全部波长的信号，然后，对二极管阵列快速扫描采集数据，得到的是时间、光强度和波长的三维谱图。
大部分常见有机物质和部分无机物质都具有紫外或可见光吸收基团，因而有较强的紫外或可见光吸收能力，因此二极管阵列检测器（DAD）既有较高的灵敏度，也有很广泛的应用范围。
4、试验材料
4.1仪器
（1）高效液相色谱仪HPLC（Agilent1200），配备：
脱气泵、四元泵、自动进样器、柱温箱和二极管阵列检测器（美国Agilent公司）
（2）振荡器：
DHZ-D型
（3）电子天平BS210S（德国Sartorious）
（4）台秤：
T-1000型电子天平
（5）PHS-3C精密pH计（上海雷磁仪器厂制造）
（6）超声波清洗器：
KQ-250DE型
（7）旋转真空蒸发器：
ZFQ-3型
（8）真空抽滤泵：
SHZ-DⅢ型
（9）分液漏斗等各种实验室通用玻璃器皿
4.2试剂
（1）99.5%二氯喹啉酸标准品（国家农药质检中心生产，广东省农科院农化研究中心提供）
（2）甲醇（一级色谱纯和分析纯）
（3）乙酸（分析纯）
（4）四硼酸钠（分析纯）
（5）水（实验用水均为二次蒸馏水）
（6）土壤及灌溉水样品（广东省烟草公司提供）
（7）0.45µ
m微孔滤膜
（8）98%浓硫酸（分析纯）
（9）无水硫酸钠（分析纯）
（10）二氯甲烷（分析纯）
（11）氯化钠（分析纯）
5.试验方法
5.1取样
土壤样品的采集按照NY/T395标准推荐的方法进行；
灌溉水样品的采集按照NY/T396标准推荐的方法进行。
（1）土壤样品
选定取样点，按对角线取5点，四分法取样200g，每份样品用两层塑料袋包装，写明标签。
在空白试验区内同期采集空白样品，置于-20℃冰箱贮存待测。
（2）灌溉水样品
选定取样点用干净的纯净水瓶采集灌溉水约1L，先用灌溉水清洗瓶子三次，然后再装灌溉水样品，加3滴浓硝酸进行酸化后拧紧瓶盖，贮存于冰箱（-20℃）中，待测。
5.2标准溶液的配制及标准曲线的建立
5.2.1二氯喹啉酸标准溶液的配制
准确称取0.0100g二氯喹啉酸标准品，用甲醇（色谱纯）溶解后定容至100mL配制成100mg/L二氯喹啉酸标准溶液，振荡摇匀后超声处理5min。
所配标准溶液置于避光环境中4℃保存，有效期为3个月，并且应监控标准储备液中二氯喹啉酸浓度。
5.2.2标准曲线的建立
采用系列稀释法，分别配制浓度为0.025、0.050、0.100、0.200、0.250、0.500、1.000mg/L的二氯喹啉酸标准溶液于高效液相色谱上检测；
以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标建立标准曲线，求出二氯喹啉酸浓度与相应峰面积的线性回归方程。
5.3提取液的配制
称取9.53g四硼酸钠，于500mL的容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分摇匀得浓度为0.05mol/L的硼砂缓冲溶液。
5.4样品前处理方法
5.4.1灌溉水样品
取50mL水样经铺有适量的Celite545助滤剂的布氏漏斗抽滤，将滤液转入250mL分液漏斗中，加入10mL5%NaCl溶液，用0.5mol/L硫酸溶液5mL调节pH值至1-2，分别用50mL、40mL、30mL二氯甲烷，萃取三次，合并有机相于烧瓶中。
加入5g无水硫酸钠静置10min，脱水后过滤于梨形烧瓶中，在旋转蒸发仪上45℃浓缩近干，用氮气吹干，再用5ml甲醇定容,过0.45μm微孔滤膜，所得溶液待高效液相色谱测定。
5.4.2土壤样品
土壤样品晾干，磨碎，过40目筛后称取50.00g，放入250mL具塞三角瓶内，加入30mL前处理提取液和60mL甲醇，在150r/min转速下振荡提取60min。
提取液经铺有适量的Celite545助滤剂的布氏漏斗抽滤，用10mL甲醇冲洗滤渣，将滤液全部转入250mL分液漏斗中，加入10mL5%NaCl溶液，用0.5mol/L硫酸溶液5mL调节pH值至1-2,分别用50mL、40mL、30mL二氯甲烷萃取三次，合并有机相于烧瓶中。
加入5g无水硫酸钠静置10min，脱水后过滤于梨形烧瓶中，在旋转蒸发仪上45℃浓缩近干，用氮气吹干，再用5ml甲醇定容，过0.45μm微孔滤膜，所得溶液待高效液相色谱测定。
5.5液相色谱条件
（1）高效液相色谱仪HPLC（Agilent1200）配二极管阵列检测器
（2）色谱柱：
C18，5μm，4.6×
250mm
（3）柱温：
30℃
（4）流动相类型：
甲醇∶1%乙酸水溶液（体积比为60/40）
（5）流动相流速：
1mL/min
（6）检测波长为：
240nm
（7）进样量：
10µ
L
5.6添加回收率试验
（1）不同土壤类型添加回收试验
土壤类型选择前茬作物为水稻，后茬种植烟草的不同地区的四种类型的土壤，作为本试验添加回收试验用土，比较不同土壤中添加回收率。
其土壤类型及采集地分别为：
红壤土-油红大土（云南大理），黄壤-麻黄泥土（广东梅县），渗育水稻土-牛肝土田（广东南雄），潴育水稻土-青市麻砂泥田土（湖南宁乡县）。
（2）土壤添加回收率试验
取空白土壤50.00g，分别添加二氯喹啉酸标准溶液0.10mg/kg（高）、0.05mg/kg（中）、0.01mg/kg（低）三个浓度水平，每个水平重复5次，按照上述前处理方法（5.4.2）和色谱条件（5.5）测定土壤添加回收率。
（3）水样添加回收率实验
取灌溉水样50mL，分别添加二氯喹啉酸标准溶液0.10mg/L（高）、0.05mg/L（中）、0.01mg/L（低）三个浓度水平，每个水平重复5次，按照上述前处理方法（5.4.1）和色谱条件（5.5）测定水样添加回收率。
5.7结果计算与表述
按照5.5的色谱条件对二氯喹啉酸标准溶液（5.2.2）进行色谱分析，做出二氯喹啉酸进样浓度与相应峰面积的线性回归方程。
每12次样品测定后应注入1个中等浓度的二氯喹啉酸标准溶液，如果测得的值与原值相差超过3%，则应重新制作新的标准曲线进行定量分析。
样品中二氯喹啉酸的残留量，按下式计算：
式中：
R—样品中二氯喹啉酸残留量，单位为毫克每千克或毫克每升（mg/kg或mg/L）
C—样品提取溶液中二氯喹啉酸的浓度，单位为毫克每千克或毫克每升（mg/kg或mg/L）
V—样品提取溶液最终定容体积，单位为毫升（mL）
W—取样量，单位为克或毫升（g或mL）
6.结果与讨论
6.1色谱条件
61.1色谱柱的选择
本标准对国内现用液相色谱柱的两家最大供应商（安捷伦和迪马）的同种类型的色谱柱，进行了优化选择。
添加0.5mg/kg二氯喹啉酸标准溶液后按照上述前处理方法处理后的样品，在以下色谱柱下进行检测，每个样品进样5次（即重复5次）；
比较保留时间和峰面积重复稳定性及差异，选择重复稳定性较好并且峰面积差异较小且分离效果较好的色谱柱作为本试验研究主要色谱柱和色谱条件。
可选择的色谱柱有：
DiamonsilC18200mm×
φ4.6mm×
5.0μm和AgilentTC-C185μm4.6×
250mm。
表1.不同厂家C18液相色谱柱出峰时间和平均峰面积比较
厂家
保留时间（min）
均值
RSD%
峰面积（UV.S）
均值
迪马
12.215
12.124
12.171
12.067
11.993
12.114
0.720
44.0
43.6
44.2
42.6
41.3
43.14
2.780
安捷伦
7.643
7.649
7.645
7.646
0.040
65
64.4
65.3
65.00
0.565
从表1中出峰时间和峰面积可以看出液相色谱柱AgilentTC-C185μm4.6×
250mm出峰时间比DiamonsilC18200mm×
5.0μm要快近5min,且5次平行测定标准偏差较小重复性较好且干扰较少，考虑到节约材料和时间等因素，因此本标准选择用AgilentTC-C185μm4.6×
250mm色谱柱作为分析用色谱柱。
两种色谱柱典型色谱图见图1.其中A为使用AgilentTC-C18色谱柱时1mg/kg二氯喹啉酸色谱图，B为使用DiamonsilC18色谱柱时1mg/kg二氯喹啉酸色谱图。
图1.不同色谱柱下二氯喹啉酸标准溶液典型色谱图
6.1.2色谱柱保留时间的重复性
用AgilentTC-C18色谱柱检测二氯喹啉酸的保留时间重复性较好，有利于获得良好的试验重复性。
日内5次测定二氯喹啉酸的保留时间的相对标准偏差为0.1%与0.2%（表2）。
表2.二氯喹啉酸在AgilentTC-C18色谱柱上的保留时间的日内精密度
样品类型
第1次
第2次
第3次
第4次
第5次
RSD（%）
土壤样品
7.877
7.876
7.884
7.894
0.1
灌溉水样品
7.821
7.811
7.808
7.825
7.778
0.2
6.1.3流速的选择
流速对色谱柱的分离有一定的影响。
高流速可以缩短分析时间，但另一方面也会使柱压大大升高，而且可能降低目标色谱峰与杂质峰的分离效果。
AgilentTC-C18色谱柱的最高耐压为400bar，因此实验选用同一标准溶液对比了0.5、0.8、1.0mL/min三种流速。
流速为0.5mL/min时，二氯喹啉酸出峰时间在16min，出峰时间过长。
流速为0.8mL/min和1.0mL/min时，二氯喹啉酸的色谱峰形和分离效果差别不大，流速为1.0mL/min的分离时间较短，在8.5min内二氯喹啉酸出峰完毕。
所以，方法选用流速为1.0mL/min。
6.1.4色谱运行时间的设定
二氯喹啉酸的色谱峰在8.5min内出峰完毕，在分析标准样品时，可把色谱运行时间设定为10min。
为了避免10min后会有杂峰出现，干扰下一个样品的检测，选取了9种不同的土壤样品进行高效液相色谱检测，色谱运行时间为120min，色谱图见图2~10。
如图可见，在120min的色谱运行时间内，目标峰出现后，只有极少的杂峰出现，而且杂峰的峰高很低，不会对下一样品的检测造成干扰。
所以，将色谱运行时间设定为10min。
标准溶液和土壤，灌溉水样品的示例色谱图见图11、图12和图13。
.
图2土壤样品（添加量为0.65mg/kg）色谱图（兖州土样）
图3土壤样品（添加量为0.65mg/kg）色谱图（重庆秀山县）
图4土壤样品（添加量为0.65mg/kg）色谱图（山东泰安）
图5土壤样品（添加量为0.65mg/kg）色谱图（深圳龙岗平湖县）
图6土壤样品（添加量为0.65mg/kg）色谱图（山东淄博）
图7土壤样品（添加量为0.65mg/kg）色谱图（河南开封）
图8土壤样品（添加量为0.65mg/kg）色谱图（福建漳州）
图9土壤样品（添加量为0.65mg/kg）色谱图（湖南邵阳）
图10土壤样品（添加量为0.65mg/kg）色谱图（河南平顶山）
图11二氯喹啉酸标准溶液（5mg/L）色谱图
图12土壤样品色谱图（添加水平为0.05mg/kg）
图13灌溉水样品色谱图（添加水平为0.05mg/L）
6.1.5流动相比例的选择
通过查阅相关文献，二氯喹啉酸高效液相检测的流动相常用的有：
甲醇和水，甲醇、水和乙酸两种组合情况。
实验使用同一标准溶液对比了甲醇∶水=80∶20，甲醇∶水=65∶35，甲醇∶1%乙酸水=60∶40，甲醇∶1%乙酸水=70∶30四种流动相比例。
流动相比例为甲醇∶水=80∶20时，二氯喹啉酸出峰时间在11min，出峰时间过长。
流动相比例为甲醇∶水=65∶35时，二氯喹啉酸出峰时间在8min，但其峰高仅为流动相比例为甲醇∶1%乙酸水=60∶40的47%。
流动相比例为甲醇∶1%乙酸水=70∶30时，出峰时间为6min，不利于某些样品的杂峰与目标色谱峰的分离。
流动相比例为甲醇∶1%乙酸水=60∶40时，二氯喹啉酸出峰时间为7~8min，且目标色谱峰与附近杂质峰的分离干净。
所以选择流动相比例为甲醇∶1%乙酸水=60∶40。
6.2样品提取
6.2.1萃取溶液浓度的选择
称取50.00g土壤样品，添加二氯喹啉酸标准溶液0.72mg/kg，按5.4.2样品前处理方法和5.5色谱条件进行样品分析，把硼砂萃取液的浓度分别设置为0.025、0.050、0.100mol/L，每个处理设置两次重复，结果见表3。
由表3可见，二氯喹啉酸在萃取液浓度为0.050mol/L和0.100mol/L时，基本提取完全。
在萃取液浓度为0.025mol/L时，提取率比浓度为0.050mol/L时低了6.9%，提取不完全。
所以选择萃取液的浓度为0.050mol/L。
表3.土壤样品中二氯喹啉酸在硼砂提取液不同浓度下的回收率*
提取液硼砂浓度（mol/L）
土样重量
（g）
土样添加二氯喹啉酸浓度
（mg/L）
实际测得二氯喹啉酸浓度（mg/L）
回收率
（%）
0.025
0.050
0.100
50.00
0.72
0.69
0.74
0.73
95.8
102.8
101.4
*表中数据为两次重复测定平均值
6.2.2硼砂提取液体积的选择
称取50.00g土壤样品四份，按前处理方法5.4.2和5.5色谱条件进行样品分析，把硼砂提取液的体积分别设置为30、40、50、100mL和60mL甲醇。
其添加回收率结果见表4。
从表中可以看出硼砂提取液体积为30、40、50、100mL时添加回收率差别不是很大，但是考虑到节约试验成本，降低费用，因此选择提取液体积为30mL硼砂缓冲液和60mL甲醇。
表4.土壤样品中二氯喹啉酸在不同体积硼砂提取液下的添加回收率试验结果*
硼砂提取液体积（mL）
30
40
50
100
添加回收率（%）
99.87
99.05
101.5
98.98
6.2.3提取时间的选择
称取土壤样品50.00g，添加二氯喹啉酸标准溶液0.65mg/kg，对同一添加二氯喹啉酸土样进行震荡提取1h、2h和5h，每个处理重复两次，其回收率结果见表5；
结果表明1h和2h无明显差别，而提取5h时回收率显著下降，考虑全国各地土壤酸碱度、粘度及对二氯喹啉酸的吸附率不同和经济等因素，本标准采用震荡提取1h。
表5.不同提取时间下的添加回收率*
提取时间（h）
土样重量（g）
测试浓度（mg/L）
1
0.658
101.3
2
0.659
5
0.445
67.56
6.3样品经层析柱净化与未经层析柱净化方法比较
称取50.00g土壤样品4份，放入250mL具塞三角瓶内，加入30mL0.05mol/L的硼砂缓冲溶液和60mL甲醇，振荡提取60min。
用铺有适量的Celite545助滤剂的布氏漏斗抽滤，用10mL甲醇冲洗滤渣，将滤液全部转入250mL分液漏斗中，加入10mL5%NaCl水溶液，用0.5mol/L硫酸5mL调节pH至1-2,用50、40、30mL二氯甲烷萃取三次，合并二氯甲烷相；
二氯甲烷相经无水硫酸钠脱水后，在旋转蒸发仪上于45℃浓缩近干，氮气吹干，其中2份用5mL甲醇定容,过0.45μm微孔滤膜，所得溶液待高效液相色谱测定。
另外2份进行柱净化，用2mL丙酮定容，移入层析柱内净化。
在层析柱内依次加入1cm无水硫酸钠，2g硅胶，1cm无水硫酸钠，用10mL丙酮预淋洗，弃去，将上述提取已浓缩丙酮定容液移入层析柱内，用40mL丙酮淋洗，收集淋洗液于45℃下浓缩近干，氮吹至干，5mL甲醇定容过0.45μm微孔滤膜，待高效液相色谱测定。
其色谱图见图14。
a：
.未经层析柱净化土壤色谱图b：
.经层析柱净化土壤色谱图
图14.未经层析柱净化和经层析柱净化样品色谱图
从色谱图中可以看出未经层析柱净化样品目标峰和杂质峰能够完全分离开，且不受杂质峰干扰，经层析柱净化和未经层析柱净化差别不是很明显；
从省时省力，节约成本等方面考虑，本标准选择土壤样品不经层析柱净化。
6.4待测液及标准储备液存放时间
为了便于批量分析及数据准确性，验证标准储备液及检测样品经提取后的待分析有效存放时间。
配制1mg/kg二氯喹啉酸标准储备液，分成12分，每3份为一组（即设置三次重复），将标准储备液放置在4℃条件下分别于0、30、60和90d取标准储备液,进行高效液相色谱检测，比较其峰面积变化情况。
表6.标准储备液在不同存放时间内二氯喹啉酸峰面积变化的测定结果*
存放时间（d）
重复1
重复2
重复3
平均值
RSD（%）
64.9
65.2
0.27
65.6
65.1
60
65.4
65.0
0.65
90
64.1
0.62
*表中数据为二氯喹啉酸1mg/kg标准储备液的色谱峰面积单位UV.S
从表6中可以看出1mg/kg标准储备液在4℃条件下存放90d后检测结果与立即检测结果差别不大；
在4℃条件下1mg/kg标准储备液存放有效期可定为90d,更高浓度的标准储备液至少可存放3个月。
称取1份土壤样品，添加0.05mg/kg水平的二氯喹啉酸标准溶液，按5.4.2进行样品前处理，样品处理好后，分成12份，分别装于12个样品瓶中。
每3个样品瓶分为一组（即设置三次重复）：
第一组，在样品处理好后立即进行高效液相色谱检测；
第二组、第三组、第四组，将待测液放置在4℃条件下分别于24、48、72h,继而进行高效液相色谱检测。
表7.样品制备完成后在不同存放时间下的测定结果*
存放时间（h）
0
22.8
22.5
22.4
22.57
0.9225
24
22.2
22.6
22.40
0.8929
48
22.40
0.7732
72
22.3
22.27
0.2593
*表中数据为土壤样品色谱峰面积单位UV.S
从表7中可以看出样品制备完成后在4℃条件下存放72h后检测结果与立即检测结果差别不大；
说明可以在4℃条件下存放72h后进行高效液相色谱检测。
6.5空白对照试验
不加入标准品，按
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