生物化学实验教案教材Word文档下载推荐.docx

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3．杜式试验：

戊糖在浓酸溶液中脱水生成糠醛，后者与间苯三酚结合成樱桃红色物质。

[实验仪器及用品]

仪器：

水浴锅。

器皿：

吸管、试管。

实验药品：

蔗糖、葡萄糖、淀粉、果糖、阿拉伯糖、半乳糖、а-萘酚、浓硫酸、95%乙醇、间苯二酚、盐酸、间苯三酚。

[实验试剂]

莫式试剂：

а-萘酚5g,溶于95%乙醇并稀释至100ml。

现用现配，并贮于棕色试剂瓶中。

塞式试剂：

间苯二酚50mg，溶于100ml盐酸（VH2O：

VHCl=2:

1），现用现配。

杜式试剂：

2%间苯三酚乙醇溶液（2g间苯三酚溶于100ml95%乙醇中）3ml,缓缓加入浓盐酸15ml及蒸馏水9ml。

临用时配制。

[实验内容及步骤]

一、莫式实验

于4支试管中，分别加入1ml1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液和少许纤维素（棉花或滤纸浸在1ml水中），然后各加莫式试剂2滴，摇匀，将试管倾斜，沿管壁慢慢加入浓硫酸1.5ml（切勿振摇！

），硫酸层沉于试管底部与糖溶液分成两层，观察液面交界处有无紫色环出现。

二、塞式试验

于4支试管中，分别加入0.5ml1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%果糖溶液，然后各加塞式试剂2.5ml，摇匀，同时置沸水浴内，比较各管颜色及红色出现的先后顺序。

三、杜式试验

于3支试管中加入杜式试剂1ml，再分别加入1滴1%葡萄糖溶液、1%半乳糖溶液和1%阿拉伯糖溶液，混匀。

将试管同时放入沸水浴中，观察颜色的变化，并记录颜色变化的时间。

四、实验现象记录

仔细观察实验中的颜色变化，对于塞式试验和杜式试验还需记录下颜色变化的时间。

实验二糖的还原作用

掌握糖的还原反应来鉴定糖的原理和方法。

费林（Fehling）试剂和本尼迪（Benedict）试剂均为含Cu2+的碱性溶液，能使具有自由醛基或酮基的糖氧化，其本身则被还原成红色或黄色的Cu2O，此法常用作还原糖的定性或定量测定。

实验仪器：

水浴锅

实验器皿：

吸管、试管

实验试剂：

硫酸酮、氢氧化钠、酒石酸钾钠、柠檬酸钠、无水碳酸钠、淀粉、蔗糖、葡萄糖。

1.费林试剂

试剂A：

CuSO4·

5H2O34.5g,溶于蒸馏水并稀释至500ml。

试剂B：

氢氧化钠125g，酒石酸钾钠137g，溶于蒸馏水并稀释至500ml。

临用时将试剂A与试剂B等体积混合。

2.本尼迪试剂：

柠檬酸钠（Na3C6H3O7·

11H2O）及50g无水碳酸钠，溶于400ml蒸馏水中。

另溶解8.5g硫酸铜于50ml热水中。

将硫酸铜溶液缓缓加入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中，边加边搅拌，如有沉淀可过滤。

此混合液可长期使用。

于3支试管中加入费林试剂A和B各1ml，混匀，分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和1%淀粉溶液1ml，置沸水浴中加热数分钟，取出，冷却，观察各管的变化。

另取3支试管，分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和1%淀粉溶液1ml，然后每支试管加本尼迪试剂2ml，置沸水浴中加热数分钟，取出，冷却，和上面结果比较。

实验三多糖的实验

1．熟悉淀粉多糖的碘试验反应原理和方法。

2．进一步了解淀粉的水解过程。

淀粉广泛分布于植物界，谷、果实、种子、块茎中含量丰富，工业用的淀粉主要来源于玉米、山芋、马铃薯。

本实验以马铃薯为原料，利用淀粉不溶或难溶于水的性质来制备淀粉。

淀粉遇碘呈蓝色，是由于碘被吸附在淀粉上，形成复合物，此复合物不稳定，极易被醇、氢氧化钠和加热等使颜色褪去，其他多糖与碘呈特异的颜色，此类呈色物质极不稳定。

淀粉在酸催化下加热，逐步水解成分子较小的糖，最后水解成葡萄糖。

器材：

研钵、布氏漏斗、抽滤瓶、表面皿、白瓷板、胶头滴管、电炉、石棉网、纱布、试管、烧杯、吸管、量筒、试管夹。

试剂：

碘化钾、碘、淀粉、氢氧化钠、本尼迪试剂，浓硫酸、碳酸钠。

一、马铃薯淀粉的制备

将马铃薯去皮，在研钵中充分研碎，加水混合，用纱布过滤，除去粗颗粒，滤液中的淀粉很快沉到底部，多次用水洗淀粉，抽滤，滤饼放在表面皿上，在空气干燥中即得。

二、淀粉与碘的反应

1．置少量自制淀粉于白瓷板上，加1-3滴稀碘液（配制2%碘化钾溶液，加入适量碘，使溶液呈淡黄棕色即可），观察颜色变化。

2．取试管1支，加0.1%淀粉5ml，再加2滴稀碘液，摇匀后，观察其颜色变化。

将管内液体分成3份，其中1份加热，观察颜色是否褪去。

冷却后，颜色是否全部恢复。

另2份加入乙醇或10%NaOH溶液，观察颜色变化并解释之。

三、淀粉的水解反应

在一小烧杯中加入1%淀粉溶液25ml及20%硫酸1ml，放在石棉网上小火加热，微沸后每隔两分钟取出反应液2滴置于白瓷板上做碘试验。

与此同时另取反应液三滴，用10%碳酸钠中和后，做本尼迪试验，记录试验结果并解释之。

实验四糖的旋光性和变旋现象

[实验目的及要求]

1．了解糖的变旋现象，掌握用糖的旋光性测定糖浓度的方法。

2．学会使用旋光仪。

光是一种电磁波，光波振动的方向与光的前进方向垂直。

普通光的光波在各个不同的方向上振动。

但如果让它通过一个尼科尔（Nicol）棱镜（用冰洲石制成的棱镜），则透过棱镜的光就只在一个方向（偏振面）上振动，这种光就叫做平面偏振光。

偏振光能完全通过晶轴与其偏振面平行的尼科尔棱镜，而不能通过晶轴与其偏振面垂直的尼科尔棱镜。

当平面偏振光通过某种介质时，有的介质对偏振光没有作用，即透过介质的偏振光的偏振面保持不变。

而有的介质却能使偏振光的偏振面发生旋转。

这种能旋转偏振光的偏振面的性质叫做旋光性。

具有旋光性的物质叫做旋光性物质或光活性物质。

具有不对称结构的手性化合物都有旋光性。

能使偏振光的偏振面向右旋的物质，叫做右旋物质；

反之，叫做左旋物质。

通常用"

d"

（拉丁文dextro的缩写，"

右"

的意思）或"

+"

表示右旋；

用"

l"

（拉丁文laevo的缩写，"

左"

-"

表示左旋。

偏振光的偏振面被旋光物质所旋转的角度，叫做旋光度，用"

α"

表示。

旋光度的大小不仅取决于物质的本性，还与溶液的浓度、液层的厚度、光的波长、测定温度以及溶剂的性质等等有关。

偏振光通过厚度为1dm，浓度含有1g/ml的待测物质的溶液所测得的旋光度称为比旋光度[α]，它是物质的一个特性常数，如下式所示：

[α]λt=α/cl

式中t：

测定时的温度；

λ：

测定时所用光源的波长；

α：

实测的旋光度；

c：

溶液的浓度（g/ml）；

l：

玻管的长度（dm）。

一个有旋光性的溶液放置后其比旋光度改变的现象称为变旋。

变旋的原因是糖从α-型变为β-型或由β-型变为α-型。

一切单糖都有变旋现象。

无α-，β-型的糖类即无变旋性。

旋光仪、电子天平。

容量瓶、烧杯、玻棒。

未知浓度的蔗糖溶液、10%葡萄糖溶液。

一、利用糖的旋光性测定糖的浓度

1．转开样品管螺母，洗净玻管，然后向管中注满蒸馏水，盖上玻片，注意管中不能有气泡，玻片上的水渍必须擦干。

2．把样品放入旋光仪内，打开电源，待钠光源稳定1-2min后，转动刻度盘，使目镜中两半圆的亮度相等，记下刻度盘的读书，以此为零点。

3．用蔗糖代替蒸馏水测其旋光度，并按公式计算出蔗糖的浓度。

二、糖的变旋现象

用新配制的10%葡萄糖溶液按上法测其旋光度并计算比旋光度，以后每隔2h测定其旋光度，计算比旋光度直至比旋光度不再改变，说明α-，β-型互变已达平衡。

实验五血糖的定量测定（葡萄糖氧化酶法）

掌握葡萄糖氧化酶法测定血糖含量的原理和方法。

D-葡糖糖D-葡萄糖酸+H2O2

[实验仪器及试剂]

试管、移液管、UNICO-2000型分光光度计、恒温水浴锅。

酶试剂：

葡萄糖氧化酶（GOD）、过氧化物酶（POD）、4-氨基安替吡啉（4-AAP）。

酚试剂：

苯酚。

标准葡萄糖溶液：

100mg/dL（5.55mmol/L）。

[实验步骤]

按下表加入各反应物：

加入物（ml）

空白管

标准管

测定管

葡萄糖标准液

——

0.020

_____

血清样品

酶试剂

1.50

酚试剂

混匀，37℃保温15min，以空白管调零，505nm波长处测定各管吸光度值。

计算血糖含量=A样/A标×

标准溶液浓度

[实验注意事项]

1.分离血清要求使用未溶血样品，否则测定结果偏大。

2.要求在30min内分离血清，糖酵解在全血中以7%/h进行。

3.样本在4℃-8℃可稳定24h,样本放置时间过长会使结果偏低。

实验六人血清中总胆固醇的测定

学会利用氧化酶法测定血清中总胆固醇含量的原理和方法。

胆固醇脂+H2O胆固醇+游离脂肪酸

胆固醇+O2⊿4-胆甾烯酮+H2O2

2H2O2+4-AA+4-氯仿醌亚胺（红色）+4H2O

CEH：

胆固醇脂酶POD：

过氧化物酶

CHOD：

胆固醇氧化酶4-AA：

4-氨基安替吡啉

醌亚胺在500nm有特征吸收，且生成量与样本中的胆固醇含量成正比，可通过测定标准品反应生成的醌亚胺的吸光度值，计算出样本中胆固醇的浓度。

标准血清、样本血清、蒸馏水、酶试剂盒。

l

样本管

2000

蒸馏水

20

____

标准血清

样本血清

A500nm

各管混匀，37℃反应6min，以空白管校零。

实验七牛奶中粗脂肪含量的测定

学习和掌握粗脂肪的定量测定法─索氏提取法。

本实验用重量法，利用脂肪能溶于脂溶性溶剂这一特性，用脂溶性溶剂将脂肪提取出来，借蒸发除去溶剂后称量。

整个提取过程均在索氏提取器中进行。

通常使用的脂溶性溶剂为乙醚或沸点为30º

C-60º

C的石油醚。

用此法提取的脂溶性物质除脂肪外，还含有游离脂肪酸、磷脂、固醇、芳香油及某些色素等，故称为“粗脂肪”。

索氏提取器（如图所示）利用溶剂回流及虹吸原理，使固体物质连续不断地被纯溶剂萃取，既节约溶利萃取效率又高。

萃取前先将固体物质研碎，以增加固液接触的面积。

然后将固体物质放在滤纸套内，置于提取器中，提取器的下端与盛有溶剂的圆底烧瓶相连，上面接回流冷凝管。

加热圆底烧瓶，使溶剂沸腾，蒸气通过提取器的支管上升，被冷凝后滴入提取器中，溶剂和固体接触进行萃取，当溶剂面超过虹吸管的最高处时，含有萃取物的溶剂虹吸回烧瓶，因而萃取出一部分物质，如此重复，使固体物质不断为纯的溶剂所萃取，将萃取出的物质富集在烧瓶中。

索氏提取器、干燥箱、电子分析天平、滤纸、棉线、干燥器、烘箱。

全脂牛奶、无水乙醚或石油醚。

1、牛奶中水分含量的测定

准确称取一定量牛奶，吸附于70℃过夜烘干的层析滤纸上，70℃烘干后（约20分钟）称量，计算水分含量。

水分含量%=（M牛奶-M干物质）/M牛奶×

100%

M干物质=M带有干物质的层析滤纸-M层析滤纸

2、牛奶中粗脂肪含量的测定

将洗净的索氏提取器小烧瓶用铅笔在磨口处编号，103-105℃烘干2小时，取出，置于干燥器中冷却，然后用电子分析天平称重，并记录。

将测完水分含量带有干物质的层析滤纸用定性滤纸包裹，称量后置索氏抽提瓶，连接已干燥至恒重的脂肪接受瓶，由冷凝管上端加入无水乙醚，加量为接受瓶的2／3体积，恒温水浴加热，控制水温，以每小时回流3-5次为宜至抽提完全为止（用滤纸试）。

取下接受瓶，在水浴上蒸干乙醚，再于100℃～105℃干燥2小时，取出放干燥器内冷却30分钟，称重，重复操作至恒重。

取出滤纸包，于户外晾至无乙醚味，置入恒温箱内，烘干，然后移入干燥缸内冷却后称重，重复操作至恒重。

计算：

（1）粗脂肪含量%=（M提取前纸包-M提取后纸包）/M干物质×

（2）粗脂肪含量%=（M接受瓶+粗脂肪-M接受瓶）/M干物质×

[注意事项]

1、乙醚为易燃有机溶剂，实验室应保持通风并禁止任何明火。

2、抽提用的乙醚或石油醚要求无水、无醇、无过氧化物，挥发残渣含量低。

因水和醇可导致水溶性物质溶解，如水溶性盐类、糖类等，使得测定结果偏高，被测样品也要事先烘干。

过氧化物会导致脂肪氧化，在烘干时也有引起爆炸的危险。

3、装样品的滤纸筒一定要严密，不能往外漏样品，但也不要包得太紧影响溶剂渗透。

放入滤纸筒时高度不要超过回流弯管，否则超过弯管的样品中的脂肪不能提尽，造成误差。

实验八牛奶中酪蛋白的提取

掌握一种提取酪蛋白及检测牛乳质量的方法。

酪蛋白是乳蛋白质中最丰富的一类蛋白质，占乳蛋白的80%-82%，酪蛋白不是单一的蛋白质，是一类含磷的复合蛋白质混合物，以一磷酸酯键与苏氨酸及丝氨酸的羟基相结合。

它还含有胱氨酸和蛋氨酸这两种含硫氨基酸，但不含半胱氨酸。

它在牛乳中的含量约为35g/L，比较稳定，利用这一性质可以检测牛乳中是否掺假。

酪蛋白在其等电点（pH4.6）时由于静电荷为零，溶解度很低，利用这一性质，将牛乳调到pH4.6，酪蛋白就可从牛乳中分离出来。

酪蛋白不溶于乙醇，这个性质被用来从酪蛋白粗制品中将脂类杂质除去。

温度计、布氏漏斗、pH试纸、抽滤瓶、水浴锅、烧杯、量筒、表面皿、天平、离心机。

市售全脂牛奶、无水乙醇、无水乙醚、pH4.7乙酸钠缓冲液0.2mol/L。

1、酪蛋白等电点沉淀

将100mL牛乳放到500mL烧杯中，加热到40℃，加入到同样40℃的乙酸钠缓冲液中，调到pH4.7。

此时有絮状的蛋白质沉淀析出。

将悬浮液冷却至室温，放置分层，3000r/min离心15min，收集沉淀。

2、水洗

将pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲溶液用蒸馏水稀释10倍，洗涤粗制品三次，离心10分钟，得到沉淀蛋白。

3、去脂

向粗制品中加入10ml无水乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中，用乙醚-乙醇混合液洗涤沉淀两次，最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。

将沉淀从布氏漏斗中移去，在表面皿上摊开除去乙醚，干燥后得到的是酪蛋白纯品。

准确称重后，计算出每100mL牛乳所制备出的酪蛋白质量（g/100mL），并与理论产量（3.5g/100mL）相比较，求出实际获得百分率。

实验九牛奶中酪蛋白含量的测定

1、学会用紫外吸收光谱法测定核酸蛋白混合物中蛋白质含量的方法。

2、掌握A224.0nm-A233.3nm测定蛋白含量的原理和方法。

蛋白质中含有酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光280nm波长处有最大吸收。

核酸及其衍生物有吸收紫外线的性质，其最高吸收峰在260nm处。

由于核酸在280nm处也有光吸收，因此当蛋白质和核酸共同存在时，测定其中任何一种物质均存在干扰。

核酸在230nm波长附近吸收值极小，如果将核酸测定值以230nm为中心，两侧存在对称而又相等的等吸收点，224nm波长处的吸收值和233.3nm波长处的吸收值相等。

蛋白质则不同，从240nm波长处向短波长处移动时，其吸收值对波长的减小吸收值呈线性增加。

因此，在240nm以下短波长一侧的核酸等吸收点中，如果测定蛋白质和核酸混合光密度值，两点间的光密度之差和蛋白质成比例关系。

该方法是格罗夫斯等1968年建立起来的，能够对浓度为5-180微克/毫升的样品作微量测定。

该方法有快速，灵敏，不破坏样品原有性质的优点，在测定完蛋白质含量后可用于其他分析。

试管、移液管、容量瓶、烧杯、玻璃棒、UNICO-2000型分光光度计。

pH7磷酸缓冲液。

用pH7的磷酸缓冲液溶解上次实验制得的酪蛋白，配置成5-180g/ml的溶液，测定其在224nm波长处和233.3nm波长处的光密度值。

按公式C蛋白质（mg/ml）=（A224-A233.3）×

210，计算浓度并反推回至每100ml牛奶中的蛋白含量。

1、在用紫外吸收光谱定量测定蛋白质时，280nm波长处蛋白质吸收光谱主要由色氨酸和酪氨酸引起，但在224-240nm波长处的紫外吸收谱不仅由这些氨基酸引起，与苯丙氨酸，组氨酸，蛋氨酸，胱氨酸及半胱氨酸也有关，因此与其他吸收紫外线的不纯物质共同存在时，就会受到显著影响，这一点也应引起注意。

2、pH值对核酸测定的等吸收点有影响。

实验十氨基酸的纸层析

了解并掌握氨基酸纸层析法的原理和方法。

用滤纸为支持物进行层析的方法，称为纸层析法。

纸层析所用的展层溶剂大多由水和有机溶剂组成，滤纸纤维与水的亲和力弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。

溶剂由下向上移动的，称为上行法；

由上向下的，称下行法。

将样品点在滤纸上，进行展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配。

由于它们的分配系数不同，不同氨基酸随流动相移动的速率就不同，形成距原点距离不等的层析点，于是便将这些氨基酸分离开来。

溶质在滤纸上的移动速率用Rf表示：

Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离

只要条件不变，Rf是常数，故可根据Rf值作定性依据。

实验器材：

滤纸、烧杯、剪刀、层析缸、微量注射器（10l）、电吹风、722型分光光度计。

氨基酸混合液

碱相熔剂：

V正丁醇:

V12%氨水:

V95%乙醇=13:

3:

3

酸相溶剂：

V80%甲酸:

V水=15:

2

显色贮备液：

V0.4mol/L茚三酮-异戊醇:

V甲酸:

V水=20:

1:

5

[实验内容及步骤]

一、标准氨基酸单向上行层析法

1．滤纸准备；

2．点样；

3．展层和显色。

二、混合氨基酸双向上行纸层析

1.准备

3．展层和显色；

4．定性鉴定与定量测量。

三、数据记录和处理

1．计算出每种标准氨基酸的Rf值；

2．混合氨基酸的Rf值；

3．对照标准氨基酸的Rf值，指出氨基酸的名称。

１. 

必须选用新华1号滤纸。

２.点样时，样点的直径不能超出0.5mm。

实验十一醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质

[实验目的]

学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳技术的一般原理。

醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维素薄膜作为支持物的电泳方法。

带电物质在电场力作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象称为电泳。

由于各种蛋白质都有特定的等电点，如将蛋白质置于pH值低于其等电点的溶液中，则蛋白质将带正电荷而向负极移动。

反之，则向正极移动。

因为蛋白质分子在电场中移动的速度与其带电量、分子的形状及大小有关，所以，可用电泳法将不同的蛋白质分离开来。

血清中含有多种蛋白质，它们的等电点都在pH7.5以下。

将血清置于pH8.6的缓冲液电泳时，所有的血清蛋白都带有负电荷，在电场中将向正极移动。

由于各种血清蛋白在相同pH时所带电荷数量不等，分子颗粒大小不一，因而泳动速度不同，经电泳被分离开来。

血清蛋白质的等电点和分子量见下表。

蛋白质名称

等电点（pI）

相对分子质量

清蛋白

4.88

69000

α1-球蛋白

5.00

200000

α2-球蛋白

5.06

300000

β-球蛋白

5.12

9000～150000

γ-球蛋白

6.85～7.50

156000～300000

本实验以醋酸纤维素薄膜（简称CAM）为支持物分离血清中的不同蛋白质。

它是一种良好的呈均一泡沫状疏松薄膜，厚约120μm，具有一定的吸水性。

[实验材料、仪器及试剂]

1．材料：

健康人血清或鸡血清。

2．仪器：

电泳仪、电泳槽。

3．试剂：

（1）醋酸纤维素薄膜；

（2）pH8.6巴比妥缓冲液（离子强度0.06～0.07）：

取巴比妥0.83克，巴比妥钠6.38克，加蒸馏水加热溶解后，定容至500ml。

（3）染色液：

取氨基黑10B0.5克，溶于50ml甲醇中，再加冰醋酸10ml，蒸馏水40ml混匀。

（4）漂洗液：

95%乙醇4.5ml，冰醋酸5ml，蒸馏水50ml混合。

（5）透明液：

95%乙醇80ml，冰醋酸20ml混合。

[实验方法]

1．准备薄膜：

将切割整齐的2.5×

6cm的薄膜条，浸入巴比妥缓冲液中浸透后，取出，用吸水纸吸去多余缓冲液。

2．点样：

仔细辩认薄膜的粗糙面与光滑面，在粗糙面距离薄膜一端1.5cm处，用铅笔轻轻划一条直线。

用玻棒蘸上血清样品，涂于盖玻片边缘处（边缘长度应比膜条宽度窄），将此边缘按压在直线上。

注意：

样品应点在薄膜的粗糙面一侧。

待血清完全渗入薄膜后，将膜面翻转，点样面（粗糙面）朝下，置电泳槽中，薄膜点样端放于负极一侧。

3．电泳：

打开电源，调节电压110～130V，电流0.4～0.6mA/cm宽，电泳时间45～60分钟，电泳完毕后，关闭电源。

4．染色漂洗：

将薄膜从电泳槽中取出，直接浸入染色液中约5分钟，再转入漂洗液中反复浸洗3～4次，直至背景颜色脱净为止。

此时，正常血清蛋白在薄膜上显示出五条区带。

从前端至点样处的方向分别为清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白及γ