作物养分高效利用的信号转导和分子调控网络Word文件下载.docx

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创制养分高效高产遗传与育种材料10-15份；

申请发明专利10-15项；

培养博士研究生50-60名；

培养硕士研究生20-30名；

培养博士后10-15名；

培养优秀青年人才8-10名。

三、研究方案

学术思路

本项目的总体学术思路为：

通过分子设计与遗传改良实现作物养分高效与高产需要回答以下问题：

1、能否通过分子调控有效地提高作物养分吸收效率并将其转化为生产力？

2、养分高效高产优良等位基因是否具有遗传聚合效应并能有效地提高养分利用效率与产量潜力？

回答上述问题需揭示作物活化土壤养分、增强养分吸收转运、高效代谢利用吸收的养分并转化为生产力途径的协同调控机制，为此本研究总体思路如下：

技术途径

利用前期筛选及创建的优异遗传与种质材料为基础，从以下层面上分析其优异材料的分子生理基础：

1、养分高效根构型建成及活化土壤养分的分子生理基础

利用已建立的二维和三维根构型定量分析系统，研究在不同土壤条件下养分供应强度变化对作物根构型（根系向地性、根系伸长、侧根分化、根毛形成）性状的影响，明确优异遗传材料养分高效根构型建成的分子生理基础。

利用模拟田间养分分布及有效性的试验体系，进行原位收集、测定根系不同部位分泌物，研究作物根系分泌物在不同土壤条件下的特征及其对土壤养分的活化作用。

再通过田间原位试验，评价优异遗传材料对不同土壤养分的活化效果，明确根系高效活化、吸收土壤养分的生理及分子机理。

2、氮、磷养分信号的分子调控网络

基于现有的优异遗传材料，结合前期克隆的氮、磷关键调控基因，通过正向遗传学方法，利用转录组学、蛋白组学、代谢组学、高通量养分分析（ICP，GC－MS等）及生理与分子生物学技术（蛋白质亚细胞活体定位，电生理等），系统研究氮、磷关键调控基因的互作网络。

利用反向遗传学方法，对该网络中的重要节点基因进行功能验证。

3、优良基因及等位变异的分离

对已筛选获得的优异遗传材料构建遗传分析群体，并进行养分高效利用性状的遗传因子定位；

对现已鉴定的氮、磷养分高效利用的QTLs，进行进一步的遗传精细作图，利用图位克隆法分离其基因；

对已克隆的参与氮、磷、钾吸收利用的关键结构与调控基因，结合TILLING和Eco-TILLING技术鉴定其养分高效高产的优良等位变异。

4、养分高效利用优良基因及QTLs的聚合效应分析

对现已鉴定的养分高效利用主效QTLs、优良基因及等位变异，利用分子标记辅助选择的方法进行聚合，结合根系定量测定、养分高通量分析等技术手段，对这些聚合材料在我国不同土壤类型的田间养分定位试验站进行养分吸收利用效率和产量性状的评价，揭示聚合效应与土壤环境和高产性状的协同关系。

5、养分高效高产田间评价协作网络的建立

为客观地评价通过遗传与分子改良对提高作物养分吸收利用效率，并最终转化为生产力的效应，有必要在我国主要粮食产区、不同土壤生态区建立养分效率田间评价协作网络，由项目统一协调，承担单位负责具体试验实施。

经上一期973资助，本项目研究团队已建立了如下3个代表不同土壤类型的长期定位试验站：

华中地区（水稻土）试验站：

水稻高效高产评价

长江下游地区（水稻土，旱作）试验站：

水稻、小麦高效高产评价

华南地区（酸性红壤，旱作与水稻土）试验站：

大豆、水稻高效高产评价

还拟新建2-3个养分定位试验站，包括：

东北地区（黑土，旱作与水稻土）试验站：

大豆、水稻、玉米养分高效高产评价

华北地区（石灰性土壤，旱作）试验站：

小麦、玉米养分高效高产评价

项目具有如下创新性：

1、研究思路新：

本项目结合我国主要土壤类型中养分有效性的实际情况，以养分高效吸收与生理利用协同调控为基础的高效高产品种培养为目标,其研究结果可直接指导生产实际中养分高效高产品种的分子设计与选育。

2、研究方法的创新性：

本项目主要研究内容涉及的研究技术已自主建立，包括根构型三维定量分析系统，养分高通量分析平台，我国不同土壤类型田间养分定位试验系统。

3、研究材料的自主性：

基于上一轮973项目的研究成果，已获得一批重要养分吸收转运的优良遗传材料及调控基因，包括转基因材料、近等基因系、优良核心种质资源及其相关遗传群体。

与国内外同类研究相比的创新点与特色

目前作物养分吸收转运及其信号转导相关成果主要来自于本项目团队所在的实验室，国际上同类研究主要集中在模式植物拟南芥上，其研究成果很难直接指导实际生产；

本研究通过前一期973项目的支持，形成了一个稳定的、优势互补的协作研究团队，能够更加有效地解决领域内重大问题，而国际上相关同行主要是以单个实验室为基础针对某个特定的科学问题加以研究，很难系统地揭示养分高效与高产的协同关系；

本研究建立的养分高通量分析平台及基于我国不同土壤类型田间养分定位试验的作物养分高效高产综合评价体系是国内外同行都难以建立的。

取得重大突破的可行性

1、项目的前沿性与已具备的工作基础

本项目瞄准作物氮、磷、钾高效吸收利用的协同调控机制，养分信号转导及其分子调控网络，养分高效与高产生理机制的协同关系，对我国特有的优异种质及自主创制的遗传材料的养分高效与高产遗传基础与分子机理开展系统研究，在理论与方法上均具有前沿性。

研究结果将回答目前植物养分高效高产研究中的关键理论问题，并为通过分子设计与遗传改良培育养分高效高产作物品种提供理论依据、遗传材料及基因资源。

相关的研究材料已自主创建，包括优良种质材料、转基因材料、遗传群体及近等基因系材料。

相关研究单位已建立了田间养分高效高产评价的长期定位试验基地，植物营养生理生化分析测试平台，功能基因组研究的先进技术体系，并与遗传育种学家建立了密切的合作关系，为实现本研究的预期目标提供了坚实的基础。

2、研究队伍包括全国的主要优势单位

本项目整合了全国从事作物氮、磷、钾养分遗传与分子生物学研究的主要优势单位，如中国科学院植物细胞与染色体工程国家重点实验室、中国农业大学和浙江大学的植物生理学与生物化学国家重点实验室、华南农业大学根系生物学研究中心、华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室、南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室、中国农业大学农业部植物营养学重点实验室等。

集聚了一批中青年学术骨干与一批近年来学成归国的留学博士。

研究队伍知识和年龄结构合理，有较强的创新能力、良好的工作积累和丰富的实践经验，学科背景齐全。

各研究组的实验室在关键技术，研究材料，设备设施上各具特色，优势互补。

3、广泛的国际合作

项目参加单位与国际上本领域高水平的实验室具有良好合作关系，如英国洛桑实验站的TonyMiller教授与赵方杰教授；

德国科隆大学的MarcelBucher教授；

德国植物遗传与栽培作物研究所（IPK）的vonWiren教授；

美国加州圣地亚哥的NIGELCRAWFORD教授，美国宾州大学Lynch教授；

Purdue大学的KGRaghothama教授；

康奈尔大学土壤与植物营养研究所LionKochian教授实验室等。

课题设置

根据总体学术思路，设置以下5个课题。

各课题之间的有机联系图示如下：

第一课题：

优良根构型建成与土壤养分活化的遗传与分子机制

1、主要研究内容与目标：

研究主要作物养分高效吸收的根构型建成及根系活化与吸收土壤养分的生理、遗传及分子基础。

利用已获得的根系高效活化、吸收土壤养分的优势遗传材料，包括重组自交系、近等基因系、转基因材料，从生理、遗传与分子水平上，在不同土壤条件下，研究作物对土壤不同形态磷、钾活化、吸收利用的机理，克隆相关基因并研究其功能。

为通过根系遗传与分子改良途径培育适应不同土壤条件的养分高效作物品种提供理论依据及基因资源，并创制养分吸收利用率显著提高的高产作物材料。

预期目标：

1）深入认识主要作物养分高效吸收的根形态建成及根系活化、吸收土壤养分的生理、遗传与分子生物学基础；

2）克隆参与调控根形态建成和磷钾活化的关键基因4-5个，创制具有理想根构型和养分吸收利用率显著提高的种质材料3-5份；

3）申请发明专利2-3项，在国内外主流学术期刊发表SCI论文10-12篇；

4）培养博士生8-10名、硕士生5-7名、博士后2-3名、青年教师2-3名。

2、承担单位：

华南农业大学，华中农业大学。

3、课题负责人及主要学术骨干：

课题负责人：

廖红教授。

主要学术骨干：

徐芳森教授、王金祥副教授、田江副研究员

4、经费比例：

15％

第二课题：

氮信号转导与吸收利用协同调控机制

研究水稻氮高效吸收转运与生理利用协同调控的信号传导及分子调控网络。

对已获得的OsNAR2.1、OsNRT2.3a和OsNRT2.3b转基因材料及具有主效QTL--qNGR9基因的优异种质材料，从生理、遗传与分子水平上进行系统研究，通过以田间养分定位试验为基础的高效高产评价体系验证其氮素吸收利用效率，克隆相关基因，探明硝酸盐转运体OsNRT2.3a、OsNRT2.3b及其伴侣蛋白OsNAR2.1、控制水稻氮营养利用效率的主效QTL--qNGR9基因在水稻氮素吸收转运中的调控机制和功能，为通过分子遗传学途径培育适应不同生态环境条件下的氮素高效水稻品种提供关键基因和创制水稻氮吸收利用率提高20%的高产材料。

1）探明硝酸盐转运体OsNRT2.3a、OsNRT2.3b及其伴侣蛋白OsNAR2.1、控制水稻氮营养利用效率的主效QTL--qNGR9基因在水稻氮素吸收转运中的调控机制和功能；

2）克隆参与氮素高效吸收利用的关键基因4-5个，创制水稻氮吸收利用率提高20%的高产材料3-5份；

4）培养博士生10-12名、硕士生6-8名、博士后2-3名、青年教师2-3名。

南京农业大学，中国科学院遗传与发育生物学研究所。

徐国华教授。

孙淑斌教授、朱毅勇副教授、袁清波助理研究员、范晓荣讲师、胡一兵讲师、张成伟博士。

4、经费预算比例：

18％

第三课题：

磷、钾信号转导与吸收利用协同调控机制

1、主要研究内容与目标

研究水稻磷高效吸收转运与生理利用协同调控的信号传导及分子调控网络，以及磷、钾高效协同关系。

利用已具备的PHR2超表达背景的高效高产遗传材料、磷信号调控相关SPX基因的转基因材料及高效高产优异核心种质材料，在生理、遗传与分子水平开展系统研究。

通过以田间养分定位试验为基础的高效高产评价体系，克隆关键基因和挖掘优良等位基因，并探明其高效高产的分子调控网络。

发展养分高效高产育种材料。

1）揭示水稻磷高效吸收转运与生理利用协同调控的信号传导及分子调控网络，以及磷、钾高效吸收利用的协同关系；

2）克隆水稻磷、钾高效吸收利用关键基因5-6个、挖掘优良等位基因2-3个，并探明其高效高产的分子调控网络；

3）发展养分高效高产育种材料4-6份（提高磷、钾吸收利用率20%以上）；

4）申请发明专利3-4项，在国内外主流学术期刊发表SCI论文12-15篇；

4）培养博士生10-15名、硕士生7-8名、博士后2-3名、青年教师2-3名。

浙江大学，中国农业大学。

课题负责人：

吴平教授。

寿惠霞教授、毛传澡副教授、莫肖蓉副教授、吴忠长副教授、刘于讲师、王毅讲师、陈新爱助理研究员

25％

第四课题：

小麦、水稻养分高效高产协同机制及优异基因的聚合效应

研究小麦、水稻氮、磷高效吸收利用与高产性状的协同机制，利用已鉴定的氮、磷高效主效QTL位点进行聚合，研究其聚合效应及其与高产的关系。

并通过与C4作物玉米的比较研究，揭示C3作物高产与养分高效协同的生理与分子机制，挖掘控制这些关键过程的优良等位基因，为C3作物养分高效高产分子设计育种提供理论依据。

1）深入认识水稻、小麦氮、磷高效吸收利用与高产性状的协同机制，探明氮、磷高效吸收利用优异基因、主效QTL位点的聚合效应及其与产量性状形成的关系；

2）在水稻、小麦基因组中鉴定和分离氮、磷吸收利用关键基因的优良等位变异3-5个。

通过优异基因和QTLs的聚合，创制高效高产遗传材料5-8份（氮效率提高15%和/或磷效率提高20%）；

3）申请发明专利3-4项，在国内外主流学术期刊发表SCI论文10-12篇；

4）培养博士生10-12名、博士后3-5名、青年研究人员2-3名。

中科院遗传发育所，华中农业大学。

凌宏清研究员。

练兴明副教授、刘冬成副研究员、赵学强助理研究员、张坤普助理研究员、张玮助理研究员、郑树松助理研究员。

32％

第五课题：

玉米养分高效高产协同机制及优异基因的聚合效应

研究玉米氮、磷养分高效吸收利用与高光合效率的协同机制，利用已鉴定的氮、磷高效利用主效QTL位点进行聚合，研究其聚合效应及其与产量形成的关系。

并通过与C3作物水稻、小麦的比较研究，揭示C4作物高产与养分高效协同的生理与分子机制，挖掘控制这些关键过程的优良等位基因，为C4作物养分高效高产分子设计育种提供理论依据。

1）揭示玉米氮、磷养分高效吸收利用与高光合效率的协同机制，探明玉米氮、磷吸收利用优异基因、主效QTLs位点的聚合效应及其与产量形成的关系；

2）鉴定和分离玉米氮、磷吸收利用关键基因的优良等位基因2-3个，通过氮、磷吸收利用关键基因及QTLs的聚合，创制高效高产遗传材料3-4份（氮效率提高15%和/或磷效率提高20%）；

3）申请发明专利2-3项，在国内外主流学术期刊发表SCI论文6-8篇；

4）培养博士生6-8名、硕士生4-6名、博士后1-2名、青年教师1名。

中国农业大学。

袁力行教授。

米国华教授、陈益芳副教授

10％

四、年度计划

年度

研究内容

预期目标

第

一

年

1.利用酵母双杂交、免疫共沉淀、超表达和RNAi等技术研究水稻OsNAR2.1、OsNRT2.3a、OsNRT2.3b调控氮素吸收利用的分子机制。

2.对水稻磷吸收调控基因OsPHF1与水稻根系发育基因ARL1的功能进行分析。

3.利用图位克隆法分离水稻氮素高效利用基因qNGR9，并定位及克隆水稻新的不定根发生缺陷突变基因。

4.构建OsAKT1的过量表达和恢复突变水稻材料；

构建水稻的酵母双杂交cDNA文库，并以OsAKT1为诱饵蛋白筛选可能的互作蛋白；

开展水稻低钾诱导基因芯片实验，筛选响应低钾胁迫信号的水稻基因；

克隆水稻OsCIPK家族和OsCBL家族的基因。

5.对水稻磷高效突变基因M8进行基因克隆，完成转基因回复实验和基因的表达、细胞定位实验；

研究M8对氮、磷、钾的吸收动力学；

开展M8材料的代谢组学初步分析；

完成M8不同氮、磷、钾水平盆栽和大田实验。

6.发展OsPHR2与OsSPX2/3/4双超表达材料。

构建SPX1/2/3/4融合TAPa和FLAG标签并转入野生型和OsPHR2超表达材料；

制备水稻OsSPX家族特异抗体。

7.分析水稻miR827和PSS1-PSS3基因在缺磷条件下的表达；

克隆以上4个基因的启动子及全长cDNA;

鉴定PSS1-PSS3的插入突变体并构建PSS1-PSS3、miR827的各类超表达、启动子报告基因载体。

8.利用水培和土培体系对小麦D基因组渗入系和小麦品种吸收和利用氮、磷效率的差异进行评价。

9.对小麦1B、2A、2D、4B和5B染色体上的5个QTL位点进行进一步精细定位，通过回交发展这5个氮磷高效QTL位点的近等基因系

10.利用EcoTILLING技术分析小麦氮磷吸收利用基因TaGS2、TaPHT1.2、TaPHR1在不同品种或遗传材料间的单核苷酸变异

11.将200份水稻微核心种质材料分别在低氮、磷条件和正常氮、磷水平下大田种植，分析每份材料的氮、磷吸收和利用效率。

12.对小麦矮秆基因Rht1的17个等位变异材料进行根系发育和氮磷养分吸收性能分析，同时通过杂交和分子标记辅助选择方法将Rht1的17个等位变异转入到同一遗传背景，观察其17个Rht1等位变异对株高和养分吸收利用的影响。

13.构建含有控制氮吸收利用主效QTL的玉米近等基因系（QTL-NIL）及其测交组合；

利用已有的根系主效QTL的qGY-1、qTRL-4近等基因系及其测交组合，研究其氮素吸收利用效率及产量特征；

利用含有根系、氮高效吸收利用QTL的供体亲本478，对2个骨干自交系（受体）沈137和PH6WC进行回交改良

14.选择我国玉米生产上广泛使用的10-12个杂交品种，在吉林和山东两地，设置不同土壤氮素供应水平处理，重点研究玉米不同基因型材料籽粒形成期氮素养分吸收、利用和分配规律。

15.利用芯片研究玉米正常供磷和低磷处理下基因表达水平，筛选明显受低磷诱导表达的转录因子（ZmWRKYa，ZmWRKYb，ZmSPXa）和磷转运体基因（ZmPHT1，ZmPHT2，ZmPHT3）；

克隆基因，构建相应的过量表达载体。

16.运用已建立的二维或三维根构型定量分析系统，研究磷供应强度对根构型和磷效率差异显著的大豆遗传材料根构型性状（主根长、根毛、侧根分化等）的影响。

17.分析油菜重组自交系的基因型，筛选获得聚合有不同磷高效特异QTL的遗传材料，创建聚合有不同磷高效特异QTL的近等基因系材料。

通过水培试验，收集油菜磷高效的重组自交系根系分泌物并做组分变化分析。

18.在酸性和石灰性土壤上，设置不同供钾处理，以钾吸收效率和利用效率为指标，对不同大豆、油菜基因型进行活化吸收土壤钾能力的田间评估及钾高效种质材料筛选。

1.在水稻中筛选获得与OsNAR2.1互作的蛋白种类及其表达特征；

获得OsNRT2.3a和OsNRT2.3b的候选转录调控因子。

2.完成水稻相关磷突变体生理分析。

克隆新基因1-2个；

获得原生质体瞬时表达初步实验数据并开展后续分析；

获得OsPHF1相关功能载体的转基因材料，完成初步分析及准备繁种；

获得可用的OsPHF1的多抗；

完成各ARL1候选靶基因转基因载体的构建及转因。

3.克隆水稻氮素高效利用基因qNGR9和水稻1-2个不定根发生缺陷突变基因。

4.获得OsAKT1的过量表达和恢复突变水稻材料；

通过酵母双杂交筛选的方法获得与OsAKT1互作的蛋白；

通过低钾芯片分析，克隆、获得响应低钾胁迫的水稻基因；

克隆、获得OsCIPK家族和OsCBL家族的大部分基因。

5.完成M8的基因克隆，完成转基因回复实验；

完成M8对氮、磷、钾的吸收动力学；

6.获得OsPHR2与OsSPX2/3/4双超表达材料；

获得超表达OsSPX1/2/3融合TAPa和FLAG标签蛋白又保留负调控功能的转基因材料；

获得特异的OsSPX1/2/3/4抗体。

7.获得PSS1-PSS3及miR827表达谱；

获得PSS1-PSS3的插入突变体；

完成各类转基因载体的构建。

8.揭示小麦D基因组渗入系和小麦品种吸收和利用氮磷效率的差异，分别鉴定出3-5份吸收效率高或利用效率高的种质材料。

9.获得小麦1B、2A、2D、4B和5B染色体上5个氮磷高效QTL位点的BC2系；

10.鉴定出小麦氮磷吸收利用基因TaGS2、TaPHT1.2、TaPHR1的单核苷酸变异体10-15个

11.初步揭示200份水稻微核心种质材料的氮、磷吸收利用效率，鉴定出氮磷高效和低效的水稻种质材料各30份

12.通过关联分析明确小麦不同Rht1基因的各等位变异与根系发育和养分吸收利用能力的关系，同时获得17个Rht1等位变异的BC1植株。

13.初步确定控制玉米根系与氮效率的2个候选主效QTL及其遗传效应。

初步构建2个含有氮高效关键主效QTL回交改良群体（BC1）。

14.初步明确可能参与协同玉米氮高效吸收利用与高效性状的生理过程。

15.从玉米中分离和克隆低磷诱导表达的候选基因6个，并构建好相应的过量表达载体。

16.明确大豆优异遗传材料磷高效根构型建成的生理及分子基础。

17.发表SCI论文5-6篇，申请发明专利1-2项。

二

1.对水稻OsNAR2.1互作蛋白进行点突变分析并鉴定OsNAR2.1与其互作蛋白间的作用位点；

2.通过水稻芯片数据分析研究这些材料中相关基因表达，分析OsNAR2.1控制或反馈调节的上下游信号基因；

3.利用OsNRT2.3b超表达材料和RNAi材料分析OsNRT2.3基因的剪切产物（OsNRT2.3b）的生物学功能；

4.利用基因沉默和过量表达技术分析qNGR9基因功能。

5.继续克隆磷吸收相关突变基因；

深入开展对OsPHF1相关的转基因材料分析；

确定重点研究的磷酸盐转运体，展开功能研究；

OsPHF1互作蛋白的验证及分析；

利用OsPHF1的Promoter:

:

GUS转基因材料发展EMS突变体库；

CHIP分析ARL1对候选基因启动子的结合；

不定根发生新突变基因的功能研究转基因。

6.检测OsAKT1突变体、过表达和恢复突变水稻材料的生物量、钾含量等生理生化指标，并比较它们在钾吸收、转运方面与野生型之间的差异；

利用双分子荧光互补和免疫共沉淀的方法进一步检测OsAKT1与其互作蛋白及OsCIPK蛋白的互作关系。

7.水稻M8突变体与高产推广品种杂交，进行分子标记辅助育种；

研究新材料的氮、磷、钾吸收动力学；

完成M8突变体在不同氮、磷、钾水平下的代谢组学分析；

开展新遗传材料的基因定位分析；

继续大田筛选突变体材料，发展F2分