双向电泳技术在生物医学中的应用现状和应用前景.doc

双向电泳技术在生物医学中的应用现状和应用前景.doc

《双向电泳技术在生物医学中的应用现状和应用前景.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《双向电泳技术在生物医学中的应用现状和应用前景.doc（7页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

双向电泳技术在生物医学中的应用现状和应用前景

1双向电泳技术

1.1双向电泳技术概述

双向电泳（two-dimensionalgelelectrophoresis,2-DE）是蛋白分离的黄金标准，由此可以分析生物样品的显著差别，产生的结果用于诊断疾病、发现新的药物靶标和分析潜在的环境和药物的毒性。

双向电泳分离技术利用复杂蛋白混合物中单个组分的电泳迁移，第一向通过电荷的不同分离，另一向通过质量的不同分离。

双向电泳协同质谱技术是正在出现的蛋白组学领域的中心技术。

双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，其高分辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是其他分离方法所无与伦比的。

双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。

可见双向电泳在蛋白质组学研究中的重要性。

就像Fey和Larsen在他们的综述中提到：

“尽管人们都想有新技术取代它，可是如果希望对细胞活动有全面的认识，其他技术无法在分辨率和灵敏度上与双向电泳相媲美”。

1.2双向电泳技术的原理

双向电泳技术是蛋白质组学研究的核心技术之一。

它利用了各种蛋白质等电点和分子量的不同来分离复杂蛋白质组分，具有较高的分辨率和灵敏度，目前已

成为复杂蛋白质组分检测和分析的最好的生化技术。

IPG-DALT系统双向电泳技术原理简明：

首先利用等电聚焦（isoelectricfocusing,IEF）将蛋白质沿pH梯度分离至各自等电点（isoelectricpoint,pI），通过电荷分离蛋白质；然后沿垂直的方向以十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecylsulphatepolyacryla-midegelelectrophoresis,SDS-PAGE），通过分子量分离蛋白质。

所得蛋白双维排列图中每个点代表样本中一个或数个蛋白质，而蛋白质的等电点、分子量和在样本中的含量也可显现出来。

蛋白双向电泳的分辨率和灵敏度很高，一般可分离1000～3000个蛋白质,最高可分辨11000个蛋白质，pI差别小于0.003个pH单位也可以被分辨。

目前在国际蛋白质数据库如SWISS-PROT和PIR中有大量的标准IPG-DALT双向电泳图谱可供查阅。

2双向电泳技术在生物医学中的应用现状

双向电泳技术在生物医学的研究中发挥着重要作用,可用于研究样品总蛋白、不同样品蛋白质表达差异、蛋白质间相互作用、蛋白质修饰等。

病原微生物的蛋白质组学研究，可以了解其毒性因子、致病机理以及药物抗性等方面，对疾病的诊断、治疗和预防非常重要。

2.1双向电泳技术在病原微生物致病机理研究中的应用

结核分枝杆菌是病原微生物研究的一个重点，Jungblut等利用双向电泳技术对结核分枝杆菌H，Rv和作为疫苗的BCG菌株的比较蛋白质组分析，有毒和

无毒的菌种之间存在25种重要蛋白质的差异，包括rplL和IJeuA编码的持家蛋白质、潜在致病性因子和一些假想蛋白质；通过双向电泳技术分析对培养基和细胞内生长的细菌进行比较，发现感染巨噬细胞的军团菌、布鲁氏菌、沙门氏菌中分别有一些特殊蛋白被诱导或被阻遏。

此外，蛋白质组学双向电泳技术可作为

致病微生物临床隔离群区分的可靠参数之一。

Jungblut等对4个幽门螺杆菌临床隔离群的比较蛋白表达图谱研究发现，按地区来源可以明显分成两组。

对29株李斯特菌属（Listeria）分离株的蛋白质组研究可归为6个亚类，其中19株产单核细胞李氏菌分为2个簇，这些与其他方法所得结果一致。

在对流感嗜血杆菌研究中发现，实验室培养的和临床分离的遗传背景相同的菌株出现了新的ORF，对临床分离株NCTC8143进行双向电泳，发现色氨酸酶的含量较高，而实验室培养的菌株中则没有色氨酸酶。

2.2双向电泳技术在病原微生物药物抗性基因功能研究中的应用

双向电泳技术可以进行微生物抗性机理的研究,Diffes等对DivercinV41抗性和野生型的产单核细胞李斯特氏菌进行2-DE分析，发现至少在17个蛋白质存在差异，抗性菌株中缺乏野生型菌株中的9个蛋白质，而新增8个蛋白质，其中只有1个RI是存在于已知该菌的数据库中，为鞭毛蛋白；机会致病真菌如

念珠菌属产生了许多的耐药菌株。

最近研究发现，伊曲康唑类化合物通过抑制真菌细胞壁的d-葡萄糖的合成而起作用，而且对耐真菌药物的菌株起作用Bruneau

等对比mulundocandin、氟康唑和伊曲康唑3种杀真菌药处理所产生的白色念珠菌双向电泳差异蛋白质图谱后认为，氟康唑和伊曲康唑在蛋白质组水平具有共同的作用机制。

Kahng等对不动杆菌的碳源分解代谢进行研究，生长在琥珀酸盐或p-hydroxybenzoate培养基不动杆菌属的A．1wofiiK24（可以分解磺胺药物前体aniline），对比它们经柱分离后的双向电泳蛋白质图谱，用N端测序和内部测序（ESI．MS／MS）鉴别了差别表达的两种原儿茶酸_3，4．二加氧酶亚基pcaH和pcaG，它们都与p-hydroxybenzoate的分解代谢有关，可能是该菌株耐药性产生的主要原因。

因此，病原微生物的耐药菌株和敏感菌株的双向电泳研究，对阐明耐药相关机制、鉴定新的药物靶位和耐药诊断标志有非常重要的价值。

2.3双向电泳技术在人类恶性肿瘤研究中的进展

人们通过双向电泳技术分离正常组织细胞与肿瘤之间的差异蛋白质组分，在寻找肿瘤的特异标志物、揭示肿瘤的发病机制以及开发新的肿瘤治疗方式和治疗药物提供理论依据等方面都取得了一些重要的进展。

肿瘤发生的早期常常无任何症状,而只有在转移时才容易被发现,这往往导致延误了治疗的最佳时期。

因此找到肿瘤早期的标志物进行及时的诊断和治疗显得尤为重要。

WadsworthJT等筛选了99例头颈部鳞状细胞癌患者和102例正常对照的血清蛋白质表达情况,发现了几种蛋白在患者与健康人中不同的表达情况，这种血清蛋白质双向电泳图谱经处理分析，确定检测到的几种蛋白质作为早期标志物可以筛选头颈部肿瘤,灵敏度及特异性分别达83.3%与100%。

膀胱癌是泌尿系统最常见的肿瘤，居所有恶性肿瘤的第八位，近年来其发病率有逐年上升的趋势。

Kageyama等通过双向电泳和质谱技术发现calreticulin（CRT）在膀胱癌组织中高表达,定量Westernblotting技术比较22例膀胱癌和10例正常膀胱上皮组织也发现calreticulin（CRT）在膀胱癌组织中高达,Westernblotting分析70例膀胱癌病人发现尿样中检测CRT的特异性为86%。

这表明CRT有可能作为临床上检测膀胱癌的诊断标志物。

通过双向电泳技术可以从整体出发在分子水平上研究恶性肿瘤的发病机制。

Alaiya等利用双向电泳技术研究了前列腺增生及前列腺癌的多肽图谱,发现增殖细胞核抗原（PCNA）、calreticulin、HSP90等9种蛋白的表达水平在恶性肿瘤中明显增加,而原肌球蛋白-1,2和cytokeration18的表达水平却明显下降。

这种变化模式与他们以前研究的多种恶性肿瘤相似，很可能为研究恶性肿瘤的发病机理提供帮助。

熊兴东等应用双向电泳技术比较了人胚永生化食管上皮细胞系SHEE和由SHEE转化而来的食管癌细胞系SHEEC的差异表达核基质蛋白（NMPs）,并利用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）鉴定出了3个差异表达核基质蛋白。

这些食管癌差异表达NMPs可能在SHEE恶性病变为SHEEC的过程中发挥重要的作用，它们的发现为进一步研究食管癌的发病机制提供了很好的基础材料。

另外，Hewett结合高分辨率的双向电泳技术和高灵敏度的化学发光技术比较了经sulpho-NHS-生物素标记的内皮膜蛋白,发现有六种蛋白的表达水平在几种不同的肿瘤血管内皮细胞（乳腺癌、肺癌）中都发生相同的改变,而这六种蛋白在不同血管床起源的肿瘤血管内皮细胞中都是上调的。

这暗示肿瘤血管介导的内皮靶标在新的肿瘤治疗方式开发研究中前景广阔。

2.4双向电泳技术在药物作用机制研究的进展

双向电泳技术的出现,为动态、高通量的研究药物作用机制提供了强有力的方法支持。

闫雪冬等利用卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞系进行铂类药物耐药相关蛋白的比较蛋白质组分析，共识别鉴定出5种蛋白质,膜联蛋白A3、破解蛋白、辅酶Ⅱ依赖的异柠檬酸脱氢酶1、谷胱甘肽转移酶omega1和丝切蛋白1可能参与卵巢癌铂类药物耐药机制的形成。

双向电泳技术的另一应用就是研究药物的毒理作用。

比较正常细胞与药物处理后细胞的蛋白质表达丰度变化，可以提示药物的毒性作用机制。

细胞在施药之后的代谢反应做出实时的检测，不仅能确定疗效，也能针对毒性代谢物质的发现而对药物进行直接的改良，是一项意义深远的发现。

廖国建等用双向电泳观察铬（六价）处理后粟酒裂殖酵母在蛋白质组水平的变化，对其中改变明显的4个斑点进行肽指纹分析发现,电压依赖型阴离子通道和锌结合醌氧化还原酶表达量降低，而S2腺苷甲硫氨酸合成酶和肌动蛋白表达量上升，说明铬（六价）可能通过氧化胁迫应答、离子通道、氨基酸生物合成等发挥生物毒理作用，研究结果为进一步认识铬分子毒理提供了基础。

3双向电泳技术在生物医学中的应用前景

双向电泳技术是蛋白质组学研究的基础技术平台.应用双向电泳技术分离肿瘤与正常组织细胞之间的差异表达蛋白可为寻找肿瘤的特异标志物、揭示肿瘤的发病机制以及开发新的肿瘤治疗方式及治疗药物等提供新途径。

电泳技术除了用于小分子物质的分离分析外，最主要用于蛋白质、核酸、酶，甚至病毒与细胞的研究。

由于某些电泳法设备简单，操作方便，具有高分辨率及选择性特点，已成为医学检验中常用的技术。

目前病原微生物蛋白质组学和肿瘤蛋白质组学的研究正在兴起，而双向电泳技术是研究蛋白质组学最关键的技术之一，广泛应用于生物医学领域的研究工作，如通过寻找差异蛋白质，发现疾病相关的蛋白质，寻找用于诊断的疾病相关标记分子，寻找疾病相关的蛋白质药靶，以用于药物设计，研究疾病的致病机理等。

随着蛋白质组学相关技术的发展，如液相2-DE，蛋白质芯片结合SELDI-MS技术的应用，蛋白质组学必将得到进一步的发展，并在疾病的发病机制、诊断和治疗方面发挥重要的作用。

蛋白质组双向电泳技术为人类疾病，特别是恶性肿瘤的早期诊断和治疗方面已显示出了广阔的前景，必将造福于人类。

参考文献：

[1]CashP.ProteomicsinmedicalmicrobiologElectrophoresis,2000,21（6）:

1187-1201

[2]刘上峰,傅俊江,综述,等.双向电泳技术原理及其应用[J].国外医学、生理、病理科学与临床分册,2002,22

（2）:

197-199.

[3]CorgA,ObermaierC,BoguthG.Thecurrentstateoftwo-dimensionelectrophoresiswithimmobilizedpHgradient..Electro-phoresis,2000,21（6）:

1187-1201

[4]JungblutPR,SchaibleUE,MollenkopfHJ,etal.ComparativeproteomeanalysisofMycobacteriumtuberculosisandMycobacteriumbovisBCGstains:

towardsfunctionalgenomicsofmicrobialpathogens.MolecularMicrobiology,1999,33,33:

1103-1117

[5]JungblutPR，Burnan