水产养殖专业专业范文Word格式.docx

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2.1.1防治优势

随着水产养殖业的迅速发展，病原菌的抗药性尤其是多重耐药性日益严重，导致临床上使用的抗菌药物难以达到治疗疾病的目的，给水产养殖业带来不同程度的损失。

使用抗菌中药及其制剂来防治鱼类细菌性疾病是一个比较理想的手段。

中药是天然绿色植物，作为我国特有的中医理论与实践的产物，以扶正祛邪、标本兼治著称，兼有营养和药用双重作用，可以有效抑制甚至杀灭细菌同时增强机体免疫力，还能促进营养物质消化吸收，此外值得一提的是，中药在机体内无残留，不会使致病菌产生耐药性。

孙红祥等人报道的由多味中药材加工研制而成的复方制剂鳖保宁，对鳖病害有显著防治疗效。

体外抑菌试验结果表明，鳖保宁及其相关单味药对养殖鳖主要病原菌温和气单胞菌有一定的抑制和杀灭作用。

其中，鳖保宁的作用最强，明显高于单味药[10]。

2.1.2有效成分及防治机理

中药对细菌之所以有抑菌作用是由于其内含有某些抑菌成分，主要包括生物碱类、甙类、挥发油类、鞣质、黄酮类、油脂类、树脂、有机酸、色素、氨基酸、多糖类以及萜类等。

如玫瑰花含有多酚类、黄铜类多种化学成分[19-20]。

这些化学成分有减少和消除自由基、抗氧化活性、抗血栓、抗癌、抗炎、抑菌、降血脂、免疫调节作用[21-22]。

木瓜果实主要含有黄酮类、有机酸类、三萜类、皂角类、糖类、酚类、鞣质等[23-24]。

这些化学物质有抗凝血、抑感染、御放射、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗衰老等作用[25]。

其中鞣质类特别具有收敛作用，能使皮肤黏膜、溃疡等局部蛋白质凝固；

能加速血液凝固而达到止血的目的；

能沉淀生物碱，对生物碱中毒有解毒作用。

黄酮类具有消除活性氧自由基，防止生物膜脂质被超氧自由基和羟自由基氧化的功能，在抗氧化、抗癌、放肿瘤方面有明显作用。

萜类化合物具有消炎、清除自由基、抗突变、抑菌、抗肿瘤、增强免疫力、降转氨酶、纠正体内异常蛋白代谢、防止肝硬化、降血脂、降血糖等作用。

多糖类具有抗凝血、抑感染、御放射、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗衰老等作用。

2.1.3应用前景

中药在水产养殖中有防治疾病、增强免疫力、促进生长、提高饲料报酬、提高成活率、促进繁殖、作诱食剂、改善水产品、减少应激、增加动物的耐受力、防霉防腐等作用[16-18]。

此外，中药具有标本兼治的特性,这一优势契合了中医所说“药有个性之特长，方有合群之妙用”的精髓。

更重要的是，中药治疗水产动物疾病不会引起药物残留和耐药菌株的产生，因而具有广阔的应用前景。

2.2其他控制手段

温和气单胞菌在水和土壤中广泛分布，主要宿主是冷血动物。

故此病的关键是预防，即加强对养殖用水的消毒净化以杀灭病原。

故平时要定时清塘；

选用健壮亲鱼进行繁殖，并严禁近亲繁殖；

加强饲养管理，采用生物、物理、化学、等方法保持优良水质及底质；

投喂优质饲料，提高鱼体抗病力；

食场周围定期泼洒消毒液进行消毒；

加强巡塘工作，每月对鱼进行抽样调查1-2次，发现病情及时进行防治；

在该病流行季节，定期用显微镜检测鱼体，杀灭鱼体外寄生虫；

发病池用过的工具要进行消毒，病死鱼要及时捞出深埋，不能到处乱扔等。

在使用各种药物进行温和气单胞菌病的预防和治疗过程中，我们还应当重视生态养殖。

生态养殖不仅能充分利用水体，提高综合效率，而且可以改善养殖水体水质，有效地预防水产病害的发生，从而减少渔药的使用量。

另一方面，我们也要加快生物渔药的研制，利用争夺水生病原微生物的栖息条件，破坏病原微生物的繁衍，以及直接吞噬病原微生物或与其进行种间的生存竞争，来达到控制水产病害的目的[13]。

3材料与方法

3.1材料

3.1.1菌株

试验用温和气单胞菌为本实验室保存菌株。

3.1.2实验药物

50种中药（如表1及图1所示），购于四川省宜宾市老百姓大药房。

3.1.3培养基

本试验采用pH为7.2-7.4的普通酵母培养基，其液体培养基配方为：

蛋白胨10g、酵母5g、氯化钠5g、水1000ml。

固体培养基为每100ml液体培养基加入2g琼脂。

表1.中药名录

Tab.1TestedChineseherbalmedicines

中药

科名

产地

药用部位

拉丁名

鸡血藤

艾叶

陈皮

北豆根

玫瑰花

薄荷

大枣

紫苏

牡丹皮

茯苓

远志

天冬

地黄

薏仁

姜黄

牛膝

金银花

石韦

栀子

山楂

桑叶

漏芦

降香

柴胡

决明子

石菖蒲

大蓟

木香

玄参

何首乌

侧柏叶

五加皮

茵陈

鱼腥草

泽泻

重楼

山慈菇

银杏叶

青黛

木通

川芎

白芍

白术

木瓜

穿破石

青蒿

大青叶

威灵仙

明党参

儿茶

豆科

菊科

芸香科

防己科

蔷薇科

唇形科

鼠李科

毛茛科

多孔菌科

远志科

百合科

玄参科

禾本科

姜科

苋科

忍冬科

水龙骨科

茜草科

桑科

伞形科

天南星科

蓼科

柏科

五加科

三白草科

泽泻科

兰科

银杏科

爵床科

木通科

十字花科

广西

四川

湖北

河北

河南

四川

山西

贵州

广东

云南

吉林

福建

安徽

藤茎

叶

橘皮

根茎

花蕾

茎叶

果实

根皮

白茯苓

根

块根

成熟种仁

花

叶片

成熟果实

心材

茎叶

成熟种子

花、叶

干燥幼苗

地上部分

假鳞茎

茎、叶

木材

根

菘蓝叶

去皮枝叶

Millettiadielsian

Artemisiaargyi

PericarpiumCitri

RhizomaMenispermi

Rosarugosa

HerbaMenthae

FructusJujubae

Perillafrutescens

CortexMoutan

Poria

RadixPolygalae

Asparaguscochinchinensis

Rehmannia

SemenCoicis

RhizomaCurcumae

Achyranthesbidentata

FlosLonicerae

FoliumPyrrosiae

FructusGardeniae

FructusCrataegi

FoliumMori

RadixRhapontici

LignumDalbergiae

RootofChnese

Catsiatora

Acorusgramineus

HerbaseuRadix

CommonVladimiria

FigwortRoot

Fallopiamultiflora

Platycladusorientalis

CortexAcanthopanacis

HerbaArtemisiae

HerbaHouttuyniae

RhizomaAlismatis

RhizomaParidis

CremastraePseudobulbus

FoliumGinkgo

IndigoNaturalis

CaulisAkebiae

RhizomaLigustici

WhitePaeony

Atractylodesmacrocephala

Chaenomelesspeciosa

Xylosmacontroversum

FoliumIsatidis

RadixClematidis

Changiumsmyrnioides

Acaciacatechu

3.2试验方法

3.2.1中药提取液制备

将供试中药置于60℃恒温干燥箱中烘至恒重，然后各取中药20g，加入200ml蒸馏水浸泡3h，然后加热至沸腾，沸后文火煮30min，滤出煎液，共煎煮3次，每次加水量200ml。

合并3次药液过滤，将滤液蒸发浓缩至浓度为1g/ml，用0.5mol/l的NaOH将药液的pH值调至中性附近，倒入EP管中密封放于121℃高温灭菌锅灭菌20min后，置于4℃冰箱中保存备用。

3.2.2培养基制备

制备液体培养基：

取蛋白胨10g、酵母5g、氯化钠5g、水1000ml于锥量杯中置于火上，沸后文火煮至液体不再腾出量杯为止，将液体倒入锥形瓶中密封，121℃高温湿热灭菌20min后，置4℃冰箱中保存待用。

固体培养基为每100ml液体培养基加入2g琼脂，制备方法同液体培养基制法。

图1中药

Fig.1Chineseherbalmedicines

3.2.3温和气单胞菌菌液制备

将温和气单胞菌菌株划线培养，28℃孵育过夜。

取单菌落种于5ml酵母液体培养基中，在恒温摇床中28℃下震荡（200r/min）培养4h,然后吸取200μL菌液均匀涂布，28℃培养24h，洗下菌苔液，用麦氏比浊法测定其浓度，将菌液浓度调整为1.0×

108CFU/ml，置于4℃冰箱中保存待用。

3.2.4测定抑菌效果

参照《中药药理实验方法学》等文献[32-33]采用平皿打孔法，在超净工作台内，向培养皿（直径为9cm）内倒入培养基，每种药液用3组平板作平行试验。

每个平板上加上200μl菌液，用棉签均匀涂抹于固体培养基上，等菌液干后，去两个平板，用直径为6.00mm的无菌打孔器在一个平板上打三个孔，另一个平板上打2个孔，其中一个平板的任意两个孔及另一个平板的两个孔注入50μl药液，其余一孔注入灭菌蒸馏水作为对照，标记药物。

将平板置于28℃恒温箱中培养24h。

观察并用游标卡尺测量抑菌圈直径，取平均值作为结果。

依照最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的结果，参照参考文献[34]将中药划分成4个等级，分别为：

抑菌圈直径小于10mm为无抑菌作用，用“-”表示；

10-15mm表示抑菌作用弱，用“+”表示；

15-20mm为中等强度抑菌作用，用“++”表示；

大于20mm为抑菌作用强，用“+++”表示。

表2.中药对温和气单胞菌的抑菌效果

Tab.2AntibacterialeffectofChineseherbalmedicinesonAeromonassobria

抑菌圈直径/mm

抑菌等级

薄荷

茵陈

青黛

20.65±

0.51

20.08±

0.05

16.54±

0.23

15.94±

0.10

14.23±

0.14

13.90±

0.36

13.82±

10.82±

0.47

10.68±

0.12

10.46±

10.31±

0.46

9.86±

0.52

9.85±

0.08

9.83±

0.19

9.53±

0.06

9.50±

9.36±

0.09

0.24

9.25±

0.28

9.14±

0.18

9.12±

0.11

9.01±

0.15

8.81±

0.17

8.78±

0.61

8.63±

0.34

8.58

8.46±

0.42

8.23±

0.04

8.05±

0.62

8.01±

0.98

7.99±

0.39

7.88±

6.73±

0.01

0.00

+++

++

+

-

注：

“+++”表示抑菌作用强，“++”表示抑菌作用中等，“+”表示抑菌作用弱,“－”表示无抑菌作用。

3.2.5测定最小抑菌浓度（MIC）

采用二倍稀释法[46]测定。

在超净工作台内，每种药物准备11支灭菌的5mlEP管，编号1-11号，每支管中分别加入1ml菌液，向1号管中加入1ml中药提取液，混合均匀后吸出1ml加入2号管中，同法依次稀释至第10号管，弃去1ml，第11号管作为不加药物只加菌液的生长对照。

使11支管内中草药液含量分别为：

500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.81、3.91、1.95、0.977、0mg/ml。

每管总量为1ml，置于28℃恒温箱中培养24h。

然后观察结果，清澈透明无浑浊现象的EP管即为无菌生长管。

无菌生长管中的最低药物浓度就是最小抑菌浓度（MinimalInhibitoryConcentration,MIC）。

每种药物重复3次，结果取平均值。

3.2.6最小杀菌浓度的测定（MBC）

在MIC试验基础上，把无菌生长的各管摇动均匀，继续培养24h，观察结果[35]，同理，清澈透明无浑浊的EP管为无菌生长管。

无菌生长管中的最低药物浓度为最小杀菌浓度（MinimalBactericidalConcentration,MBC）。

表3.中药对温和气单胞菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度

Tab.3MICandMBCofChineseherbalmedicinesonAeromonassobria

MIC/mg.ml-1

MBC/mg.ml-1

7.81

31.25

62.50

125.00

＞250.00

15.63

3.3结果与分析

3.3.1不同中药的抑菌效果比较

50种中药的抑菌活性各不相同，如表2所示。

其中，木瓜、玫瑰花的抑菌圈很明显，直径分别为（20.65±

0.51）mm、（20.08±

0.05）mm，抑菌作用强（+++）；

儿茶、白芍有中等强度的抑菌效果（++）；

山楂、紫苏等7种中药的抑菌强度弱（+）;

而柴胡、茵陈等39种中草药无抑菌作用（-）。

各抑菌强度的效果见图2。

1：

木瓜2：

玫瑰3：

山楂4：

紫苏5：

薄荷6：

远志7：

木香8：

Note:

1:

Chaenomelesspeciosa2:

Rosarugosa3:

FructusCrataegi4:

Perillafrutescens5:

HerbaMenthae6:

RadixPolygalae7:

CommonVladimiriaRoot8:

LignumDalbergiae

图2抑菌效果图

Fig.2Diagramofantibacterialeffect

3.3.2中药对温和气单胞菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度

选取抑菌圈直径大于10mm的中药进行MIC和MBC的测定，测定结果如表3所示。

木瓜对温和气单胞菌的抑菌作用最强，MIC和MBC均为7.81mg/ml，其次是五倍子，MIC和MBC分别为7.81mg/ml和15.63mg/ml。

儿茶、白芍等5种中药有一定的抑菌和杀菌作用，MIC和MBC介于15.63mg/ml与250.00mg/ml之间；

其余4种中药均无明显抑菌和杀菌作用，MIC和MBC均大于250mg/ml。

4讨论

本实验结果表明，在试验条件相同的情况下，木瓜和玫瑰花的抑菌效果最好，其抑菌圈直径达20mm以上；

其中，木瓜的MIC和MBC相同，为7.81mg/ml；

玫瑰花的MIC和MBC值分别为7.81mg/ml和15.63mg/ml。

儿茶、白芍等9种中药有一定的抑菌和杀菌效果，抑菌圈直径在10-20mm之间；

其中薄荷等4种中药的MIC和MBC均大于250mg/ml；

其余5种中药的MIC和MBC均介于15.63mg/ml与250.00mg/ml之间。

在具有抑菌作用的药物中，山楂、金银花、大青叶3种中药已有报道。

本试验结果显示山楂的抑菌圈直径为（14.23±

0.14）mm，而梁利国等[42]报道山楂的抑菌圈直径为（10.50±

0.70）mm。

本试验结果显示金银花和大青叶无抑菌作用，而彭金菊等[44]报道的金银花抑菌浓度为50mg/ml，何爱华等[45]报道的大青叶的抑菌浓度为14mg/ml。

主要原因可能与中药的采集地、采集季节、采集年龄、药用部位、储藏及煎煮方法以及本试验将中药提取液的pH值调至中性附近有关，有实验表明pH值对抑菌效果有很大的作用。

此外，也可能与菌株不同有关。

中药对细菌之所以有抑菌作用是由于其内含有某些抑菌成分。

玫瑰花含有多酚类、黄酮类多种化学成分[46-47]。

这些化学成分有减少和消除自由基、抗氧化活性、抗血栓、抗癌、抗炎、抑菌、降血脂、免疫调节作用[48-49]。

木瓜果实主要含有黄酮类、有机酸类、三萜类、皂角类、糖类、酚类、鞣质等[50-51]。

这些化学物质有抗凝血、抑感染、抗肿瘤、抗炎、抗病毒的作用[52]。

能沉淀生物碱，对生物碱中毒有解毒作用[15]。

通过本次试验，证明木瓜等50种中药对温和气单胞菌的抑制作用差异较大，木瓜、玫瑰花对温和气单胞菌的体外抑制作用最强，儿茶、白芍等9种中药有中等强度的抑菌和杀菌效果。

试验结果说明，使用中药防治由温和气单胞菌引起的水产动物疾病具有其可行性。

但本试验只是测定中药中具有直接抗菌活性的成分对病原菌的抑、杀菌作用，很多中药的抑菌机理还不能测出。

而且，由于中药抑菌活性成分在离体和在