磺化聚二氟乙烯PVDF在质粒DNA酶切体系Word下载.docx

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磺化聚二氟乙烯正是满足了以上条件。

首先，聚二氟乙烯（PolyvinylideneDifluoride）膜常用于实验室中的蛋白质操作，而在此之前对其的研究也一直集中于其在蛋白质测序或分析中的应用。

它作为一种性能稳定的聚合物，可以抵抗强酸、有机溶剂和还原剂的腐蚀，并与蛋白质依靠氢键或静电亲和力可逆结合，常用于微量蛋白质的测序操作，是一种常见且理想的蛋白质固相吸附剂。

其次，通过将聚二氟乙烯粉末样品磺化，一方面可以利用磺化样品中的–SO3H基团在碱性环境中电离形成的–SO3－强负电基团与带正电的蛋白质结合，从而提高对其限制性内切酶的吸附力。

另一方面，由于–SO3－所带有的负电性，可以有效排斥质粒DNA与吸附剂的结合，降低吸附剂对质粒DNA吸附造成的损失。

本实验正是基于以上的思路，首先设计出一套简便的聚二氟乙烯样品磺化途径，并在与未磺化样品及某一商品化的DNA纯化试剂盒的对照基础上，肯定了此种纯化策略的可行性和优越性。

随后测定了所得样品的磺化程度、对质粒DNA的单位吸附量和对限制性内切酶的单位吸附量，以及吸附反应动力学曲线，找出对于常见的质粒DNA酶切体系纯化所需的最适磺化聚二氟乙烯样品用量，使所得结果获得充分的实用价值和广阔的应用前景。

首先它可以替代现有的一些质粒DNA酶切纯化体系，由于纯化策略的改变而有效的降低目标质粒DNA的损失率。

其次，它可能用于PCR体系的纯化过程，而简便PCR产物的后续连接操作。

另外，大量制备的磺化样品可能成为一种有效的蛋白质纯化柱填料，其带有的强负电性可以用于带正电的蛋白质（主要为DNA结合蛋白，如RecA蛋白、HetR蛋白等）的纯化过程，替代目前所用的如肝素等类似填料，而此项研究正在进行中。

实验材料与基本方法

一．实验材料：

1．实验所用聚二氟乙烯[（-CH2-CF2-）n]样品粉末购自美国AldrichChemicalCompany，分析纯。

2．实验所用pET3a-S、pET3d及pAQE19质粒和大肠杆菌DH5α菌株由本实验室保存。

3．所用限制性内切酶均购自TaKaRa公司。

4．对照用DNA纯化试剂盒购自赛百盛生物工程公司。

5．所用分光光度计为SHIMADZUUV-2501PC型，由本实验室提供；

所用DNA凝胶检测仪为复日科技FR-200紫外与可见分析仪，由朱玉贤教授实验室提供。

6．其它常规仪器均由本实验室提供。

7．其它试剂均为国产分析纯，各种溶液配方见《分子克隆实验指南》。

二．实验基本方法：

1．制备E.coliDH5α感受态：

挑取单菌落于1.5mLLB培养液中，37℃振荡培养过夜。

取100μL过夜培养物转接于20mLLB培养液中，37℃振荡培养1～2h，至OD600=0.4左右，4,000rpm1min离心收集菌体，加入灭菌的0.1MCaCl2溶液悬浮菌体，冰浴30min，4℃4,000rpm10min离心，弃去上清，加入2mL0.1MCaCl2溶液重悬菌体，于冰上放置20h左右，此时转化效率最高。

如需保存，则加入无菌甘油至15%浓度，分装于1.5mLEppendorf管中，于-70℃保存。

2．转化DH5α感受态：

向100μLDH5α感受态中加入5μL所需扩增的质粒，冰上放置30min，42℃热激90s，冰上放置3min。

全部涂布于LB（Ampr）固体培养基上，37℃培养16小时。

3．大量碱法提取质粒DNA：

挑取平板上阳性菌落，转接于40mLLB（Ampr）液体培养基,37℃振荡培养16小时。

将菌液转移至50mL离心管中，4℃10,000rpm5min离心，弃上清，沉淀重悬于1mL溶液Ⅰ（25mMTris-HCl，pH8.0；

50mM葡萄糖；

10mMEDTA）中，混匀后冰浴放置5min，加入2mL新配制的溶液Ⅱ（0.2MNaOH；

1%SDS），冰浴放置5min，再加入1.5mL溶液Ⅲ（3MK+；

5MAc－，pH5.2），冰浴5min，4℃10,000rpm10min离心，取上清。

加入等体积氯仿，抽提一次，10,000rpm10min离心，取下层水相。

再重复用等体积氯仿抽提一次，以尽量除去蛋白杂质，10,000rpm10min离心，取下层水相加入0.6倍体积的异戊醇，轻轻振荡混合均匀，10,000rpm1min离心，弃去上清。

用70%的乙醇洗涤沉淀两次，将离心管倒置于滤纸上，晾干。

4．DNA纯化试剂盒回收质粒DNA：

向所需纯化的体系中加入0.4mL纯化树脂（使用前摇匀），充分混匀3min。

将混合液装入离心纯化柱，13,000rpm30s离心，倒掉收集管中的废液。

加入500μL80%的乙醇，13,000rpm30s离心，倒掉收集管中的乙醇。

重复洗涤一次，此步骤13,000rpm2min离心，倒掉收集管中的乙醇后，再13,000rpm30s离心，务必将乙醇除尽。

将纯化柱套入干净的1.5mL离心管中，加入40μLddH2O于纯化树脂上，不能粘在管壁上，室温放置3min后，13,000rpm30s离心，即为回收产物。

实验步骤

1．标准质粒的制备：

为避免pET3a-S质粒上原有EcoRⅠ单一酶切位点可能带来的酶切反应困难而影响结果的测定，故将pET3a-S质粒在EcoRⅠ位点切开，连入一段300bp的外源基因片断，从而得到EcoRⅠ的双切位点，构成“标准质粒”（如图一所示），记为pET3a-S。

通过转化E.coliDH5α扩增该质粒，用大量碱法提取质粒DNA，溶于400μLddH2O，混匀后-20℃冷冻备用。

图一，pET3a改造得到的“标准质粒”pET3a-S。

2．样品的制备：

将约0.5克样品粉末在5mL苯乙酮或甲醇中浸润，维持60℃30min后，4,000rpm5min离心除去液体，60℃烘干5min。

在通风柜中逐滴加入5mL氯磺酸，维持60℃30min。

再在室温下依次用1,2-二氯乙烷、甲醇和水各洗脱30min。

每次均离心4,000rpm5min除去液体，在烘箱中彻底烘干。

最后，将样品放入研钵中，加入少量液氮，充分研磨粉碎。

推测其反应历程如图二所示：

图二。

聚二氟乙烯样品磺化反应历程。

其中氯磺酸通过脱水生成氯磺酰正离子，与聚二氟乙烯发生亲电取代反应得到氯磺酰聚二氟乙烯，再经过磺酰基的水解反应，得到磺化聚二氟乙烯产物。

另外，由于可能存在二氟乙烯基直接脱氢的副反应，使得多个二氟乙烯基之间相互交联，而出现纤维状磺化聚二氟乙烯产物。

3．磺化程度检验：

用离子交换能力衡量。

将一定量的磺化样品浸入20.00ml含有约0.05NNaOH的1.25N的NaCl溶液中，40℃维持1h。

同时称取等量的未磺化样品，进行对照反应。

随后离心移去样品粉末，用pH计测定各自上清溶液的pH值，计算出样品的磺化程度。

结果用每克干重样品所含有硫酸的毫克当量（meq./g.）表示，所谓干重即将样品干燥恒重后的重量。

4．比较磺化样品和未磺化样品对质粒DNA的吸附量：

准确称取约0.1g的磺化样品和未磺化样品，按1g:

10mL的比例加入甲醇，充分振荡制成悬浊液备用。

分别吸取两种样品悬浊液10.0μL，即相当于固体样品1.00mg，10,000rpm1min离心，尽量除去甲醇。

加入20.0μL的1×

TAE（40mMTris-乙酸；

1mMEDTA，pH8.0）溶液洗涤样品，10,000rpm1min离心，除去液体。

再加入20.0μL1×

TAE溶液重悬，随后加入不同量的pET3a-S质粒，室温吸附30min后，10,000rpm1min离心，上清液用1×

TAE稀释至3.00mL，用分光光度计在260nm处测定体系光吸收值（Abs）。

同时测定未经吸附处理的对应等量标准质粒DNA直接用1×

TAE稀释至3.00mL的体系光吸收值，计算出两种样品对质粒DNA的各自吸附比例，比较磺化对吸附结果的影响。

5．使用DNA纯化试剂盒进行回收对照：

将5.0μLpET3a-S质粒加入12.0μLddH2O、2.0μLBufferH及1.00μL限制性内切酶EcoRⅠ中，作为模拟酶切体系。

用DNA纯化试剂盒进行回收，所得产物用1×

TAE稀释至3.00mL，260nm处测定体系光吸收值，与上述磺化样品对5.0μLpET3a-S质粒吸附结果比较。

6．测定不同量的磺化样品对质粒DNA的吸附比例曲线：

吸取不同量的磺化样品悬浊液，10,000rpm1min离心，尽量除去甲醇。

加入20.0μL1×

TAE溶液洗涤，10,000rpm1min离心，除去液体。

TAE溶液重悬，随后加入5.0μLpET3a-S质粒，室温吸附30min后，10,000rpm1min离心，上清液用1×

TAE溶液稀释至3.00mL。

在260nm处测定体系光吸收值，计算不同量磺化样品对质粒DNA的吸附比例，得到磺化样品对质粒DNA的吸附比例曲线。

7．测定不同量的磺化样品对限制性内切酶的吸附比例曲线：

以限制性内切酶EcoRⅠ为例。

吸取不同量的磺化样品悬浊液，10,000rpm1min离心，尽量除去甲醇。

加入10.0μLddH2O洗涤，10,000rpm1min离心，除去液体。

再加入12.0μLddH2O、2.0μLBufferH及1.00μLEcoRⅠ重悬，室温吸附30min后，10,000rpm1min离心，取上清液加入5.0μLpET3a-S或pET3d质粒，与未经吸附处理的对照酶切体系共同37℃酶切1h后进行凝胶电泳。

利用DNA凝胶检测仪测定已切开和未切开的质粒DNA比例，与对照酶切体系结果比较，计算出不同量磺化样品对酶的吸附比例，得到磺化样品对限制性内切酶的吸附比例曲线。

8．测定不同量的未磺化样品对限制性内切酶的吸附比例曲线：

吸取不同量未磺化样品悬浊液，10,000rpm1min离心，除去甲醇。

加入10.0μLddH2O洗涤，10,000rpm1min离心，除去上清液。

再加入12.0μLddH2O、2.0μLBufferH及1.00μLEcoRⅠ重悬，室温吸附30min后，10,000rpm1min离心，取上清液加入5.0μLpET3d质粒，与未经吸附处理的对照酶切体系共同37℃酶切0.5h后进行凝胶电泳。

利用DNA凝胶检测仪测定已切开和未切开的质粒DNA比例，与对照酶切体系结果比较，计算出不同量未磺化样品对酶的吸附比例，得到未磺化样品对限制性内切酶的吸附比例曲线，与上面所得磺化样品对限制性内切酶的吸附比例曲线比较。

9．求得吸附用最佳磺化样品量：

比较磺化样品对质粒DNA和限制性内切酶的吸附比例曲线，求得最佳磺化样品吸附剂用量，使得对限制性内切酶有99%（或95%）以上的吸附率，同时质粒DNA的损失率最小。

10．测定磺化样品对限制性内切酶吸附反应动力学曲线：

吸取10.0μL磺化样品悬浊液，10,000rpm1min离心，尽量除去甲醇。

加入10.0μLddH2O洗涤，10,000rpm1min离心，除去液体。

再加入12.0μLddH2O、2.0μLBufferH及1.00μLEcoRⅠ重悬，分别在室温下吸附1min、2min、5min、10min、20min后，10,000rpm1min离心，取上清液加入5.0μLpET3d质粒，与未经吸附处理的对照体系共同37℃酶切1h后进行凝胶电泳。

利用DNA凝胶检测仪测定已切开和未切开的质粒DNA比例，与对照酶切体系结果比较，计算出不同时间内磺化样品吸附比例，得到磺化样品对限制性内切酶的吸附反应动力学曲线。

11．检测磺化样品处理后体系对限制性内切酶酶活的影响：

为排除在微碱性环境中，磺化样品水解产生–SO42-，或存在无法离心除去的微粉末而引起的限制性内切酶失活的可能性，以EcoRⅠ为例，取磺化样品悬浊液10.0μL，10,000rpm1min离心，尽量除去甲醇。

再加入12.0μLddH2O及2.0μLBufferH重悬，室温浸泡1h后，10,000rpm1min离心，上清液加入5.0μLpET3a-S质粒及1.00μLEcoRⅠ，与未经处理的对照酶切体系共同37℃酶切0.5h后电泳，利用DNA凝胶检测仪测定经过处理与对照酶切体系所得各条带的DNA比例，比较酶活变化情况。

12．检验磺化样品对其他限制性内切酶的作用：

取最佳用量的磺化样品悬浊液，10,000rpm1min离心，尽量除去甲醇。

加入10.0μLddH2O洗涤，10,000rpm1min离心，除去液体。

再加入12.0μLddH2O、2.0μL相应Buffer及1.00μLBamHⅠ、HindⅢ或PstI重悬，室温吸附30min，10,000rpm1min离心，取上清液，加入5.0μLpET3d质粒，与未经吸附处理的对照酶切体系共同37℃酶切1h后电泳。

利用DNA凝胶检测仪测定已切开和未切开的质粒DNA比例，与对照酶切体系结果比较，计算出磺化样品对其他限制性内切酶的吸附比例。

13．实际应用效果检验：

以上所考虑均为简单情况，即吸附体系中只有质粒DNA或者限制性内切酶，而实际情况中，质粒DNA和限制性内切酶处于混合体系中，两者可能结合为某种复合物形式。

这种复合物的存在，可能影响磺化样品对限制性内切酶的吸附能力。

为了排除这种可能性，设计实际应用体系，以限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ为例。

取12.0μLddH2O、2.0μLBufferH、1.00μLEcoRⅠ及5.0μLpET3a-S质粒，37℃酶切2h。

加入最适量的磺化样品，室温吸附30min，10,000rpm1min离心后分为两组，一组中取上清液加入5.0μLpAQE19质粒，另一组取上清液加入5.0μLpAQE19质粒和1.00μLBamHⅠ，与未经吸附处理的各对照酶切体系共同37℃酶切1h后，进行凝胶电泳，与各个对照酶切体系结果比较，确定吸附效果。

数据结果及讨论

1．制得磺化样品0.222g，取0.100g样品悬于1.000mL甲醇中备用。

2．用于水解的磺化粉末样品干重为0.0574g，测得水解磺化样品后的溶液pH=12.27，水解未磺化样品后的溶液pH=12.32，计算得磺化程度为0.79meq./g.。

3．测得不同量质粒DNA经过磺化样品和未磺化样品吸附后的体系光吸收值（Abs）如下表：

其中分光光度计零点误差=0.016

DNA量（μL）

未经吸附

修正值

未磺化样品

磺化样品

0.0

0.014

-0.002

0.018

0.002

2.0

0.104

0.088

0.100

0.084

0.089

0.073

5.0

0.250

0.234

0.226

0.210

0.200

0.184

10.0

0.474

0.458

0.428

0.412

0.391

0.375

15.0

0.711

0.695

0.663

0.647

0.624

0.608

20.0

0.939

0.923

0.890

0.874

0.849

0.833

将各组修正值归零，得到两种样品对质粒DNA的吸附曲线如图三。

由于在低浓度条件下体系的光吸收值与质粒DNA的浓度成正比关系，可得：

磺化样品吸附

△Abs

吸附比例

未磺化样品吸附

0.090

0.082

0.008

9%

0.071

0.019

21%

0.236

0.208

0.028

12%

0.182

0.054

23%

0.460

0.410

0.050

11%

0.373

0.087

19%

0.697

0.645

0.052

7%

0.606

0.091

13%

0.925

0.872

0.053

6%

0.831

0.094

10%

图三。

磺化样品和未磺化样品对质粒DNA的吸附曲线：

1．未经过吸附处理的对照质粒DNA体系光吸收值。

2．经过磺化样品吸附。

3．经过未磺化样品吸附。

两种样品对质粒DNA的吸附量曲线如图四。

可见经磺化样品吸附体系的质粒DNA损失率约在10%左右，显著低于经未磺化样品吸附体系的质粒DNA损失率（约20%左右），约为其损失率的一半.。

因此，磺化反应所减少的聚二氟乙烯样品对质粒DNA吸附损失的效果是很明显的。

图四。

磺化样品和未磺化样品对质粒DNA的吸附量曲线：

以与未经过吸附处理的体系光吸收值之差△Abs表示。

1．经过未磺化样品吸附的体系。

而经过DNA纯化试剂盒纯化回收的5.0μL质粒DNA体系光吸收值Abs=0.124，经过修正后Abs=0.108，与对照的未处理体系Abs=0.236相比，损失率高达50%以上。

由以上结果可以得到结论，一方面固相吸附质粒DNA的纯化策略损失率大大高于经磺化聚二氟乙烯样品处理体系的损失率；

另一方面，磺化反应确实显著降低了吸附剂对质粒DNA的吸附损失。

从而用实验证明了新的纯化策略的理论正确性和优越性。

另外，由吸附比例及吸附量的变化可知，当加入的质粒DNA量在10.0μL左右时，样品出现饱和吸附现象，此时质粒DNA的损失率最大。

而当体系中质粒DNA的量大于10.0μL时，样品粉末的吸附量已经基本恒定，其具体值与粉末表面积和磺化与否有关，由此也可以看出磺化反应使得聚二氟乙烯样品对质粒DNA的饱和吸附量下降为原来的一半左右。

4．得不同量的磺化样品对质粒DNA吸附后的体系光吸收值（Abs）如下表：

其中分光光度计零点误差=0.011

磺化样品量（mg）

0.10

0.20

0.50

1.00

1.50

Abs

0.252

0.239

0.237

0.232

0.225

0.218

修正后的Abs

0.241

0.228

0.221

0.214

0.207

5.4%

6.2%

8.3%

11.2%

14.1%

得到磺化样品对质粒DNA的吸附比例曲线如图五。

可见，磺化样品对质粒DNA的吸附比例与样品的量并不是简单的线性关系，而是类似于某种双曲线形状。

推测此种现象可能与磺化样品在体系中的分散状况有关，即此时体系的体积对吸附比例起主要作用。

图五。

不同量磺化样品对质粒DNA的吸附比例曲线。

5．测得不同量的磺化样品对限制性内切酶EcoRⅠ的吸附情况如图六（以pET3a-S质粒为例）。

由于为了准确测定体系中的酶量，所控制的酶切时间较短，酶切反应进行的很不完全，使得出现多条质粒DNA酶切条带的现象。

实验证明，如果反应程度充分，则只会得到简单的EcoRⅠ双切图谱。

但是，由于反应进行不充分，便可能出现质粒完全没有切开、超螺旋被破坏、只有一个EcoRⅠ位点切开及两个EcoRⅠ位点均被切开等不同情况，而得到多条带的酶切图谱。

但是，由于酶切时间较短，且对于后几组体系实际反应

图六。

不同量磺化样品对DNA限制性内切酶EcoRⅠ吸附后的酶切电泳图谱。

A，DNA分子量标记。

B，未被酶切的pET3a-S质粒空白对照。

C，未经吸附处理的DNA限制性内切酶EcoRⅠ的酶切结果。

D～H，被不同量的磺化样品吸附后的DNA限制性内切酶EcoRⅠ的酶切结果。

其中箭头所指位置为未被切开的质粒DNA，其余条带则为被切开的质粒DNA。

另外，C在300bp处应有一条带，为被切下的外源DNA，略去。

酶量相对于质粒DNA的量较少，可以认为酶切反应为一级反应，即酶切产物的质粒DNA的量与体系中的酶量成正比关系。

又因为各种不同状态的质粒DNA（如完全未切开和只有一个EcoRⅠ位点被切开）与酶的反应可近似看作不存在差异，因此可以将各酶切条带的质粒DNA量合并处理为反应产物量，即其与体系酶量成正比关系，从而使计算