生物制药工艺学复习总结Word文档下载推荐.docx

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②对热敏物质破坏少；

③采用多级萃取时，溶质浓缩倍数大、纯化度高。

2、简述选择萃取溶剂应遵守的原则。

①分配系数愈大愈好，若分配系数未知，则可根据“相似相容”的原则，选择与药物结构相近的溶剂；

②选择分离因数大于1的溶剂；

③料液与萃取溶剂的互溶度愈小愈好；

④尽量选择毒性低的溶剂；

⑤溶剂的化学稳定性要高，腐蚀性低，沸点不宜太高，挥发性要小，价格便宜，来源方便，便于回收。

第五章沉淀法（答案）

一.填空

1.固相析出法主要包括盐析法，有机溶剂沉淀法，等电点沉淀法，结晶法及其它多种沉淀方法等。

2.按照一般的习惯，析出物为晶体时称为结晶法，析出物为无定形固体则称为沉淀法。

3.影响盐析的因素有：

无机盐的种类、溶质（蛋白质等）种类的影响、蛋白质浓度的影响、温度的影响、pH的影响

4.结晶包括三个过程：

（1）形成过饱和溶液；

（2）晶核形成；

（3）晶体生长。

5.影晶体大小的主要因素，归纳起来与过饱和度、温度、搅拌速度、晶种等直接有关。

6.晶体的质量主要是指晶体的大小、形状和纯度等3个方面

二．选择

1、在一定的pH和温度下改变离子强度（盐浓度）进行盐析，称作（A）

A．KS盐析法B．β盐析法C．重复盐析法D．分部盐析法

2、当向蛋白质纯溶液中加入中性盐时，蛋白质溶解度（C）

A．增大B.减小C.先增大，后减小D.先减小，后增大

3、盐析法与有机溶剂沉淀法比较，其优点是（B）

A.分辨率高B.变性作用小C.杂质易除D.沉淀易分离

4、当向蛋白质纯溶液中加入中性盐时，蛋白质溶解度（C）

5、盐析常数Ks是生物大分子的特征常数，它与下列哪种因素关系密切。

（B）

A．盐浓度B.盐种类C.溶质浓度D介质pH

6、将配基与可溶性的载体偶联后形成载体-配基复合物，该复合物可选择性地与蛋白质结合，在一定条件下沉淀出来，此方法称为（A）

A．亲和沉淀B．聚合物沉淀C．金属离子沉淀D．盐析沉淀

7、将四环素粗品溶于pH2的水中，用氨水调pH4.5—4.6，28－30℃保温，即有四环素沉淀结晶析出。

此沉淀方法称为（B）

A．有机溶剂结晶法B．等电点法C．透析结晶法D．盐析结晶法

8、影响体大小的主要因素与下列哪些因素无关（D）

A．过饱和度B．温度C．搅拌速度D．饱和度

9、下列沉淀试剂不属于表面活性剂的是（D）

A．CTABB．CPCC．SDSD．PEG

三名词解释：

1.盐析法：

是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀析出，达到纯化目的的方法。

2.Ks盐析：

在一定的pH和温度下改变离子强度（盐浓度）进行盐析，称作Ks盐析法。

Ks盐析法多用于提取液的前期分离工作。

3．β盐析：

在一定离子强度下仅改变pH和温度进行盐析，称作β盐析法。

在分离的后期阶段，为了求得较好的分辨率，或者为了达到结晶的目的，有时应用β盐析法。

β盐析法由于溶质溶解度变化缓慢且变化幅度小，沉淀分辨率比KS盐析法好。

4．亲和沉淀:

利用亲和反应原理，将配基与可溶性的载体偶联后形成载体-配基复合物（亲和沉淀剂），该复合物可选择性地与蛋白质结合，在一定条件下沉淀出来。

四问答

1.什么是盐析作用？

盐析的原理是什么？

盐析作用：

向蛋白质溶液中逐渐加入中性盐，在高盐浓度时，蛋白质溶解度随之减小，发生了盐析作用。

产生盐析作用的一个原因是由于盐离子与蛋白质表面具相反电性的离子基团结合，形成离子对，因此盐离子部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间电排斥作用减弱而能相互靠拢，聚集起来。

盐析作用的另一个原因是由于中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化而使蛋白质脱去了水化膜，暴露出疏水区域，由于疏水区域的相互作用，使其沉淀。

2.如何选择盐析所用中性盐？

（1）盐析作用要强。

一般来说多价阴离子的盐析作用强，有时多价阳离子反而使盐析作用降低。

（2）盐析用盐要有足够大的溶解度，且溶解度受温度影响应尽可能小。

这样便于获得高浓度盐溶液，有利于操作，尤其是在较低温度下的操作，不致造成盐结晶析出，影响盐析效果。

（3）盐析用盐在生物学上是惰性的，不致影响蛋白质等生物分子的活性，最好不引入给分离或测定带来麻烦的杂质。

（4）来源丰富、经济。

3.有机溶剂沉淀的原理是什么？

亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀；

水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。

4.有机溶剂沉淀影响沉淀效果的因素有那些？

（1）有机溶剂种类及用量

（2）pH的影响

（3）温度无机盐的含量

（4）某些金属离子的助沉淀作用

（5）样品浓度

第六章吸附分离法（答案）

一、填空

1、吸附剂按其化学结构可分为两大类：

一类是有机吸附剂，如活性炭、淀粉、大孔吸附树脂等；

另一类是无机吸附剂，如白陶土、氧化铝、硅胶、硅藻土等。

2、常用的吸附剂有活性炭、硅胶和白陶土等。

3、大孔网状聚合物吸附剂是在树脂聚合时加入惰性致孔剂，待网格骨架固化和链结构单元形成后，用溶剂萃取或蒸馏水洗将致孔剂去掉，形成不受外界环境条件影响的孔隙，其孔径远大于2～4nm，可达100nm，故称“大孔”。

4、大孔网状聚合物吸附剂按骨架的极性强弱，可分为非极性、中等极性、极性和强极性吸附剂四类。

二、选择题

1、用大网格高聚物吸附剂吸附的弱酸性物质，一般用下列哪种溶液洗脱（D）

A.水B.高盐C.低pHD.高pH

2、“类似物容易吸附类似物”的原则,一般极性吸附剂适宜于从何种溶剂中吸附极性物质（B）

A.极性溶剂B.非极性溶剂C.水D.溶剂

3、“类似物容易吸附类似物”的原则,一般非极性吸附剂适宜于从下列何种溶

剂中吸附非极性物质。

（A）

A.极性溶剂B.非极性溶剂C.三氯甲烷D.溶剂

4、下列属于无机吸附剂的是：

（A）

A.白陶土B.活性炭C.淀粉D.纤维素

5、活性炭在下列哪种溶剂中吸附能力最强？

A.水B.甲醇C.乙醇D.三氯甲烷

6、关于大孔树脂洗脱条件的说法，错误的是：

A.最常用的是以高级醇、酮或其水溶液解吸。

B.对弱酸性物质可用碱来解吸。

C.对弱碱性物质可用酸来解吸。

D.如吸附系在高浓度盐类溶液中进行时，则常常仅用水洗就能解吸下来。

三、名词解释

1、吸附法（adsorptionmethod）：

指利用吸附作用，将样品中的生物活性物质或杂质吸附于适当的吸附剂上，利用吸附剂对活性物质和杂质间吸附能力的差异，使目的物和其它物质分离，达到浓缩和提纯目的的方法。

2、大网格高聚物吸附剂（macroreticularadsorbent）：

在合成树脂时，加入一种惰性组分，它不参与聚合反应，但能和单体互溶，称为致孔剂。

待网络骨架固化和链结构单元形成后，用溶剂萃取或水洗蒸馏的方法将致孔剂去掉，就留下了不受外界条件影响的永久孔隙，其孔径远大于2~4nm，可达到100nm甚至1000nm以上，故称“大孔”。

与大孔网状离子交换树脂相比，它不含离子交换树脂的功能团，仅保留了多孔的骨架，其性质与活性炭、硅胶等吸附剂相似，称为大孔网状聚合物吸附剂。

四、问答题

1、简述吸附法的定义和特点。

吸附法（adsorptionmethod）指利用吸附作用，将样品中的生物活性物质或杂质吸附于适当的吸附剂上，利用吸附剂对活性物质和杂质间吸附能力的差异，使目的物和其它物质分离，达到浓缩和提纯目的的方法。

吸附法具有下列特点：

（1）设备简单、操作简便、价廉、安全。

（2）少用或不用有机溶剂，吸附与洗脱过程中pH变化小，较少引起生物活性物质的变性失活。

（3）天然吸附剂（特别是无机吸附剂）的吸附性能和吸附条件较难控制，吸附选择性差，收率不高，难以连续操作。

2、影响吸附的因素有哪些？

1吸附剂的特性：

吸附现象在界面发生，因此吸附剂比表面积愈大，吸附量愈多。

通过活化的方法也可增加吸附剂的吸附容量。

另外还要求吸附剂的机械强度好，吸附速度快

2吸附物的性质：

能使表面张力降低的物质，易为表面所吸附；

一般极性吸附剂易吸附极性物质，非极性吸附剂易吸附非极性物质；

溶质从较易溶解的溶剂中被吸附时，吸附量较少；

对于同系列物质，吸附量的变化是有规则的；

吸附物若能与溶剂形成氢键，则吸附物极易溶于溶剂之中。

3吸附条件：

温度：

吸附热越大，温度对吸附的影响越大。

PH值：

溶液的pH值溶液pH值可控制吸附剂或吸附物解离情况，进而影响吸附量，对蛋白质或酶类等两性物质，一般在等电点附近吸附量最大。

盐浓度：

溶剂的影响：

单溶剂与混合溶剂对吸附作用有不同的影响。

4吸附物浓度与吸附剂用量

一般情况下吸附物浓度大时，吸附量也大。

第七章凝胶层析

一、填空题

1、凝胶层析的分离原理有凝胶层析的分离原理有平衡排除理论、扩散分离理论、流动分离理论。

这三种分离原理是互相补充的，在通常情况下平衡排除理论起主导作用；

扩散分离理论的作用随流速增加而加强；

只有在流速很高时流动分离理论才起作用。

2、琼脂糖凝胶的一个特征是分离的分子量范围非常大，其分离范围随着凝胶浓度上升而下降，颗粒强度随浓度上升而提高。

3、凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。

一般来说，细粒凝胶柱流速低，洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分离等。

粗粒凝胶柱流速高，洗脱峰平坦，分辨率低，多用于多用于脱盐等。

4、在作分级分离时，为了提高分辨率，多采用比样品体积大25倍以上的柱体积，

25以上的柱比，较大吸液量、较细粒的凝胶固定相。

5、溶质通过色谱柱时造成的峰加宽效应包括分子扩散、涡流扩散、流动相中传质阻力、固定相中传质阻力。

6、葡聚糖凝胶的孔径大小取决于交联度，其越小，凝胶孔径越大；

而琼脂糖凝胶的孔径却依赖于琼脂糖浓度。

1、凝胶层析中，有时溶质的Kd>

1，其原因是（B）

A.凝胶排斥B.凝胶吸附C.柱床过长D.流速过低

2、凝胶层析中，有时小分子溶质的Kd<

1，其原因是（A）

A.水合作用B.凝胶吸附C.柱床过长D.流速过低

3、在凝胶层析中样品各组分最先淋出的是（B）

A.分子量最大的B.体积最大的C.分子量最小的D.体积最小的

4、为了进一步检查凝胶柱的质量，通常用一种大分子的有色物质溶液过柱，常见的检查物质为蓝色葡聚糖，下面不属于它的作用的是（C）

A.观察柱床有无沟流B.观察色带是否平整

C.测量流速D.测量层析柱的外水体积

5、在选用凝胶层析柱时，为了提高分辨率，宜选用的层析柱是（A）

A.粗且长的B.粗且短的C.细且长的D.细且短的

1、全排阻：

当具有一定分子量分布的高聚物溶液从柱中通过时，较大的分子完全不能进入颗粒内部，只能从颗粒间隙流过，称“全排阻”。

其流经体积最小，等于外水体积V0。

2、类分离：

将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作类分离或组分离.选择凝胶时，应使样品中大分子组的分子量大于其排阻限，而小分子组的分子量小于渗入限。

大分子的分配系数Kd=0，小分子的Kd=1。

3、分级分离：

将分子量相差不大的大分子物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，分级分离应尽量使待分离各物质的Kd值相差大些，并使分子量分布不在凝胶分离范围的一侧。

4、柱比：

层析柱的长度与直径的比值一般称作“柱比”。

5、操作压：

凝胶层析柱由于进出口之间液位压力差形成的对凝胶颗粒的压力称作“操作压”。

6、全渗入：

被分离组分的分子量小于该种凝胶的渗入限，其分子可以自由进出凝胶颗粒，这叫做“全渗入”。

其流经体积最大，等于外水体积与内水体积之和，V0＋Vi。

7、分离度Rs：

式中Ve1、Ve2——对应于两个峰的淋出体积；

W1、W2和σ1、σ2——两个峰宽度和标准偏差。

1、试述公式Ve=V0+KdVi各字母的物理意义。

公式Ve=V0+KdVi中Ve代表被分离组分的流经体积，V0代表外水体积，Vi代表内水体积。

Kd称作“排阻系数”或“分配系数”，它反映了物质分子进入凝胶颗粒的程度。

对一定种类规格的凝胶，物质的Kd值为该物质的特征常数。

排阻系数：

当Kd=1时，洗脱体积Ve=V0+Vi，为全渗入。

当Kd=0时，洗脱体积Ve=V0，为全排阻。

0＜Kd＜1时，洗脱体积Ve=Vo+KdVi，为部分渗入。

2、利用凝胶层析如何测定蛋白质的分子量？

当具有一定分子量分布的高聚物溶液从柱中通过时，较小的分子在柱中停留时间比大分子停留的时间要长，于是样品各组分即按分子大小顺序而分开，最先淋出的是最大的分子（2分）。

对于一个特定体系（凝胶柱），待测定物质的洗脱体积与分子量的关系符合公式

Ve=-KlogM+C

先以3个以上（最好更多些）的已知分子量的标准蛋白过柱，测取各自的Ve值。

以Ve作纵坐标，logM作横坐标制作标准曲线（2分）。

在同一测定系统中测取未知物质的Ve值便可由标准曲线求得分子量（2分）。

3、凝胶层析的应用主要有哪些？

并说明其原理。

应用：

一、脱盐：

脱盐用的凝胶多为大粒度的，高交联度的凝胶。

此时溶液中蛋白质等大分子的Kd=0，盐类的Kd=1。

由于交联度大，凝胶颗粒的强度较好，加之凝胶粒度大，柱层操作比较便利，流速也高。

二、分子量测定：

Ve=-KlogM+C

以Ve作纵坐标，logM作横坐标制作标准曲线。

在同一测定系统中测取未知物质的Ve值便可由标准曲线求得分子量。

三、分离纯化：

根据分子量不同流出先后顺序不同，收集单一洗脱峰的物质，得以纯化。

第八章离子交换法

1、离子交换剂由惰性的不溶性载体、功能基团和平衡离子组成。

平衡离子带正电荷为阳离子交换树脂，平衡离子带负电荷称阴离子交换树脂。

2、常见的离子交换剂有离子交换树脂，离子交换纤维素，葡聚糖凝胶离子交换剂等。

3、离子交换树脂的基本要求有有尽可能大的交换容量、有良好的交换选择性、

化学性质稳定、化学动力学性能好和物理性能好。

4、影响离子交换选择性的因素主要有离子价与离子水合半径、离子价与离子浓度、交换环境、树脂结构、偶极离子排斥等。

5、请写出下列离子交换剂的名称和类型：

CM-C的名称是羧甲基纤维素，属于弱酸型阳离子交换纤维素;

DEAE-C的名称是二乙基氨基乙基纤维素，属于强碱型阴离子交换纤维素;

。

6、色谱聚焦（chromatofocusing）是一种高分辨的新型的蛋白质纯化技术。

它是根据蛋白质的等电点，结合离子交换技术的大容量色谱，能分离几百毫克蛋白质样品，洗脱峰被聚焦效应浓缩，分辨率很高，操作简单。

7、写出下列离子交换剂类型：

732强酸型阳离子交换树脂，724弱酸型阳离子交换树脂，717强碱型阴离子交换树脂，CM-C阳离子交换纤维素,DEAE-C阴离子交换纤维素，PBE94阴离子交换剂。

8、在采用多缓冲阴离子交换剂作固定相的离子交换聚焦色谱过程中，当柱中某位点之pH值下降到蛋白质组分PI（等电点）值以下时，它因带正电荷而下移，如果柱中有两种蛋白组分，pI值较大（高）者会超过另一组分，移动至柱下部pH较高的位点进行聚焦（交换）。

9、影响离子交换选择性的因素有离子水合半径、离子价与离子浓度、交换环境、树脂结构、偶极离子排斥。

1、用钠型阳离子交换树脂处理氨基酸时，吸附量很低，这是因为（C）

A.偶极排斥B.离子竞争C.解离低D.其它

2、在酸性条件下用下列哪种树脂吸附氨基酸有较大的交换容量（C）

A.羟型阴B.氯型阴C.氢型阳D.钠型阳

3、在尼柯尔斯基方程式中，K值为离子交换常数，K＞1说明树脂对交换离子吸引力（）。

A.小于平衡离子B.大于平衡离子C.等于平衡离子D.其它

1、蛇笼树脂：

由丙烯酸或甲基丙烯酸在季胺型阴离子交换树脂（如Dowex）中聚合而成的一类树脂称蛇笼树脂。

它是一种两性树脂，它适宜于从有机物质（如甘油）水溶液中吸附盐类，再生时用水洗，就可将吸着的离子洗下来。

2、尼柯尔斯基方程式：

即

其中m1、m2及C1、C2分别代表树脂上和溶液中的两种离子的浓度。

K值的大小取决于树脂和交换离子的性质，以及交换条件。

K＞1时说明离子A1比离子A2对树脂有较大的吸引力；

反之，K＜1时树脂对A2的吸引力大于A1。

3、偶极离子排斥作用：

许多生化物质都是两性物质。

其中有些是偶极离子。

因为它们即使净电荷为零时，正电中心和负电中心并不重叠，遂成偶极。

偶极离子在离子交换过程中的行为是很特殊的。

现以氨基酸的离子交换为例。

式中由于使用了钠型树脂，被吸附氨基酸的羧基所带的负电荷与树脂磺酸基之负电荷产生排斥力。

这就是所谓偶极离子的排斥作用。

因此使树脂对氨基酸的吸附量大大降低。

1、简述离子交换纤维素的特点有哪些？

离子交换纤维素的特点是：

离子交换纤维素为开放的长链骨架，大分子物质能自由地在其中扩散和交换，亲水性强，表面积大，吸易附大分子；

交换基团稀疏，对大分子的实际交换容量大；

吸附力弱，交换和洗脱条件缓和，不易引起变性；

分辨力强，能分离复杂的生物大分子混合物。

2、请以CM-C为例说明离子交换纤维素分离纯化蛋白质时的洗脱方法有哪些？

并说出各种方法的洗脱原理。

无论是升高环境的pH还是降低pH或是增加离子强度都能将被吸附物质洗脱下来。

现以羧甲基纤维素为例加以说明，图中H2N-P表示蛋白质，C表示纤维素。

（1）、升高环境的pH，使蛋白质在此pH下失去电荷，从而丧失与CM-C结合力而被洗脱下来。

（2）、降低环境的pH，使CM-C在此pH下不解离，从而不能吸附蛋白质而被洗脱下来。

（3）、用高浓度的同性离子根据质量作用定律将目的物离子取代下来。

3、请以DEAE-C为例说明离子交换纤维素分离纯化蛋白质时的洗脱方法有哪些？

（1）、升高环境的pH，使DEAE-C在此pH下不解离，从而不能吸附蛋白质而被洗脱下来。

（2）、降低环境的pH，使蛋白质在此pH下失去电荷，从而丧失与DEAE-C结合力而被洗脱下来。

4、由下图，利用给出的两种离子交换剂（E1，E2）分离3种蛋白质（P1、P2、P3），用箭头流程图表示（并指出E1，E2的类型）。

E1为阴离子交换剂

E2为阳离子交换剂

5、下图为离子交换法应用实例，请填写生产工艺流程中的空格（可选因素：

阴离子交换树脂，阳离子交换树脂，0.05mol/L氨水，0.1mol/L氨水，2mol/L氨水）。

简述从“滤液”开始，以后步骤的分离原理？

阳离子交换树脂，0.05mol/L氨水，0.1mol/L氨水，2mol/L氨水

滤液调节到pH2.5时，氨基酸带正电荷，因此选用阳离子交换树脂，之后根据氨基酸等电点的不同，依次用0.05mol/L氨水，0.1mol/L氨水，2mol/L氨水洗脱。

酸性氨基酸等电点低，因此用0.05mol/L氨水就可洗脱下来，而碱性氨基酸等电点高，因此需用2mol/L氨水才能将之洗脱下来。

第九章亲和纯化技术

1、亲和层析洗脱方法有非专一性洗脱，特殊洗脱，专一性洗脱。

2、亲和力大小除由亲和对本身的解离常数决定外，还受许多因素的影响，其中包括亲和吸附剂微环境、载体空间位阻、载体孔径、配基和配体的浓度、配基结构等。

3、亲和层析中常用作分离酶的配基有酶抑制剂，辅酶，底物和底物结构类似物。

4、亲和层析中非专一性吸附有离子效应、疏水基团、复合亲和力。

5、亲和过滤指的是将亲和层析和膜过滤技术结合运用，它包括亲和错流过滤和亲和膜分离两大方法。

1、下面关于亲和层析载体的说法错误的是（B）

A.载体必须能充分功能化。

B.载体必须有较好的理化稳定性和生物亲和性，尽量减少非专一性吸附。

C.载体必须具有高度的水不溶性和亲水性。

D.理想的亲和层析载体外观上应为大小均匀的刚性小球。

2、制备亲和柱时，应首先选用的配基是（A）

A.大分子的B.小分子的C.中等大小的D.不确定

3、亲和层析的洗脱过程中，在流动相中加入配基的洗脱方法称作（C）

A.阴性洗脱B.剧烈洗脱C.竞争洗脱D.非竞争洗脱

4、亲和层析的洗脱过程中，在流动相中减去配基的洗脱方法称作（D）

A.阴性洗脱B.剧烈洗脱C.正洗脱D.负洗脱

1、亲和反胶团萃取（Affinity-basedresersedmicellarextraction）：

是指