分子生物学考点整理8Word格式文档下载.docx

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包含催化部位

Thumb：

结合DNA

核算外切酶结构域

N-terminal结构域

5DNA聚合酶的功能：

持续合成，校对功能，3’-5’外切酶活性，保真度

6半不连续复制

（1）前导链：

5’→3’连续合成的DNA链

（2）后随链：

整体是由3’→5’不连续地合成，每个片段是5’→3’合成（随后连接起来）

（3）冈崎片段：

不连续复制过程中产生的100-200碱基长度的DNA片段，之后会被连接成连续的DNA链

（4）半不连续复制：

在DNA新链合成时，一条链连续合成，另一条链则不连续合成

7DNA的合成需要引物

（1）引物：

一段和一条DNA链互补的小片段（通常为RNA），以提供自由的3’-OH末端供DNA聚合酶合成脱氧核苷酸链

（2）引物酶：

一种RNA聚合酶。

合成一小段RNA，作为DNA合成的引物

（3）所有DNA聚合酶都需要3’-OH末端来启动DNA的合成

提供3’-OH末端的：

RNA引物，DNA的缺口，启动蛋白

8DNA复制的起始：

需要多种酶的作用，包括解旋酶、单链结合蛋白、引物的合成

9DNA复制时酶单元在两条链上表现不相同

10DNA聚合酶III包括多个单元（clamploader,βdimer,coreenzyme等）

DNA聚合酶III全酶分阶段装配，产生合成两条新链的DNA的酶复合物。

·

首先，clamploader利用ATP的水解将β亚基结合到模板引物复合物上

与DNA的结合改变与clamploader结合的βclamp上位点的构象，因此对核心聚合酶具有高亲和力。

这使得coreenzyme结合，这是coreenzyme被带到DNA上的手段。

τdimer结合coreenzyme，并提供结合第二个coreenzyme（与另一个βclamp相关）的二聚化功能。

全酶是不对称的，因为它只有一个clamploader。

Clamploader负责向每个亲本DNA链添加一对βclamp。

11βclamp功能：

紧密结合DNA单链，使DNA聚合酶能够沿着DNA链延伸

12Theloopingmodel

产生复制叉的解旋酶连接到两个DNA聚合酶催化亚基，每个通过滑动夹具保持在DNA上。

合成前导链的聚合酶连续移动。

合成滞后链的聚合酶在Okazaki片段的末端解离，然后在单链模板环中与引物重新缀合以合成下一个片段。

证据：

电镜照片

每个DNA聚合酶III的一个核心酶合成一条子链。

13冈崎片段合成完毕后，DNA合成酶I移除引物并合成DNA补齐RNA引物造成的缺口，由DNA连接酶连接成一整条DNA链

FEN1：

核酸内切/外切酶，切除RNA引物

14真核生物DNA合成酶

DNApolymeraseα：

引物酶复合体，开始形成DNA链

DNApolymeraseε：

延长先导链

DNApolymeraseδ：

延长后随链

DNApolymeraseβ：

高保真度修复，其他低保真度修复

15真核生物的clamp结构和clamploader

PCNAring带着RFC在DNA的小沟上滑动

16参与DNA复制的组件

17DNA复制中其他需要的蛋白

包括RNA引物酶、PCNA、FRC、解旋酶、单链结合蛋白（大肠杆菌中为SSB，真核生物为RPA）和连接酶

（1）RNA引物酶：

可直接合成一段RNA引物

（2）DNA解旋酶解开DNA螺旋（利用ATP水解的能量）

DNA解旋酶结构：

六个亚单元构成的结构，能够水解ATP

（3）单链结合蛋白：

结合单链DNA，防止DNA单链结构形成发夹结构

18生成复制叉，需要DnaA、DnaB、DnaC、HU、促旋酶和单链结合蛋白

6个DnaC单体结合在DnaB上，结合在起始位点

起始位点包含3个13bp的重复序列和4个9bp的重复序列

4个DnaA单体结合到4个9bp的序列，

折叠，结合到13bp重复序列

DNA序列在13bp重复序列解开

3个13bp的重复序列全部解开，才可以招募2DnaBand2DnaC，然后消耗ATP，释放DnaC

19复制起点

甲基化DNA双链复制后形成半甲基化DNA，直到dam甲基化酶使半甲基化的DNA完全甲基化。

OriC起始位点包含11个重复序列，两条链上的腺嘌呤全部甲基化；

半甲基化的DNA不能复制，13min后两条链都会被甲基化

20复制后起始位点可能会被隔离

半甲基化的DNA会被链结合抑制剂结合，以防止和DnaA结合；

当DNA被完全甲基化后即被释放

原核生物：

半甲基化的DNA起始位点被membrane-boundinhibitor（seqA）结合，直到子链被甲基化才释放

真核生物：

ORC招募Cdc6然后招募MCM开始解旋，Cdc6只在G1期合成，其降解会阻止复制重新开始

21拓扑异构酶：

增加或释放DNA超螺旋

（1）拓扑异构酶I：

通过打开单链DNA作用不需要能量

（2）拓扑异构酶II：

通过打开双链DNA增加超螺旋需要水解ATP

二DNA重组

1定义：

精确对应的序列间的DNA重排

分类：

一般重组（同源重组）、位点特异性重组

2关键词

（1）同源重组：

DNA的相互交换，例如携带相同遗传位点的染色体

（2）位点特异性重组：

发生在两个特定（不一定同源）序列之间，例如在噬菌体整合/切除或转座期间整合结构的解析

（3）转座：

转座子移动到一个新的位点上

（一）同源重组

1同源重组：

发生在减数分裂的四分体时期；

可以发生在两个同源核苷酸链的任何地方，创建可以长达数千碱基对的异源双链区；

在交换位点没有核苷酸序列改变

联会复合体结构：

包括轴向元件、横向元件、中心元件

2分裂期的重组：

•通过在一个（受体）DNA双链体中产生双链断裂起始重组

•核酸外切酶作用产生侵入另一（供体）双链体的3'

单链末端

•新的DNA合成替代已降解的物质

•产生了一个重组连接分子，其中两个DNA双链体通过异源双链DNA连接

3Spo11切开双链，产生双链断裂（Double-strandbreaks,DSBs）

RecBCD复合物在重组中有核酸酶和解旋酶的作用：

RecBCD结合chisequence下游DNA序列，解开形成粘性末端；

通过chisequence后RecD即与复合物解离，复合物失去核酸酶作用

RecA催化链交换

RuvSystem解开Holliday节点

RuvA四聚体和四条链都相连，识别节点

RuvB环绕DNA结合，催化支迁移

RuvC裂开节点形成重组中间体

4Rad51（真核生物）是RecA的同系物

Rad51：

催化双链DNA和单链DNA之间的联会反应

Brca2：

招募Rad51到单链DNA，催化交换。

5同源重组的作用：

修复DNA的损伤，导致基因变异

（二）位点特异性重组

1位点特异性重组有两个机制：

转位位点特异性重组，保守位点特异性重组

2核心概念：

（1）转座子：

基因组中的移动离散序列

（2）转座酶：

被转座子编码，将转座子从原DNA序列上解离，插入新的目标位点

3转座子的性质

突变不稳定，频繁地部分转变，产生新的表型

一些与染色体的破坏有关

经常在有丝分裂和减数分裂中移动

基因损伤时，转座子的移动加速

4转座子分子分析

-在基因组中多拷贝

-插入位点与转座子没有相似同源性

-末端是反向重复序列

-编码促进移动的转座酶

-Ashort,directrepeatofgenomicDNAoftenflanksthetransposon:

“Footprint”

5逆转录病毒样的逆转座

整合酶机制

无逆转录病毒逆转座

保守的位点特异性重组

6三种转座子：

DNA-onlytransposons,Retroviral-likeretrotransposons,Non-retroviralretrotransposons

三DNA修复

（一）细胞对DNA损伤的应答

（二）细胞对DNA损伤的应答：

信号传导通路

1大肠杆菌中的SOS应答：

20多种酶参与

DNA损伤→产生RecA，导致LexA自裂解→目标基因表达，激活SOS应答

2原核细胞中的DNA损伤的结果

DNA修复：

导致许多DNA修复基因的表达，包括recA,uvrA,uvrB和uvrD

诱变：

激活低保真度的跨损伤DNA聚合酶跨过DNA损伤

3真核生物中的DNA损伤应答

DNA损伤激活ATR（单链损伤）和ATM（双链损伤）→ATR和ATM激活一系列酶（包括Chk1和Chk2）→引起一系列生理效应

4DNA损伤检查点蛋白

（1）DNA损伤检查点：

延迟或阻止细胞周期进程响应DNA损伤的生化途径

Sensorsdetectdamage

↓

Mediators传导信号到Transducers

Tranducers启动或抑制下游effectors

（2）G1/S期检查点

DNA损伤可以被ATM（双链断裂）/ATR（单链断裂）探测到（Rad17-RFC和9-1-1complex探测UV损伤），ATM/ATR磷酸化Rad17,Rad9,p53,andChk1/Chk2，Chk1/Chk2磷酸化Cdc25A，被细胞核排除被泛素化降解。

Cdc25A的降解不能使Cdk2去磷酸化，磷酸化的Cdk2不能使Cdc45去磷酸化，而去磷酸化的Cdc45才能起始复制。

P53Ser15byATM/ATRandonSer20byChk1/Chk2磷酸化p21WAF-1/Cip1transcription,andp21WAF-1/Cip1bindstotheCdk4/CycDcomplex,阻止Rb的磷酸化，磷酸化的Rb才能释放E2F转录因子和S期的基因。

p21WAF1/Cip1也结合并使Cdk2/CycA复合物失活，从而确保G1/S检查点的维持。

（3）DNA检查点蛋白

（4）DNA损伤位点的蛋白动力学

DNA损伤的checkpoint和修复因子、调节因子被招募到DNAbreak，当转录机器离开时，thedynamicsofstructuralchromatincomponentsoperateinbothdirections。

（5）DNA双链损伤的DDR蛋白的空间组织。

DDR蛋白在DSB位点开始积累，通过一个反馈圈在一定范围内传导，这个圈涉及MDC1（γH2AX,theMRNcomplex），ATMkinase（磷酸化多余的H2AX分子），空间的DDR蛋白在DSB位点分布，参与ATR信号的因素积累在DNA末端切除产生的ssDNA上的断裂位点附近，而ATM信号因子定位在侧翼染色质区域。

（6）DNA断裂时DDR蛋白积累的时间调节

ADDR招募有时间顺序