申报国家自然科学基金项目申请书样板Word下载.docx
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近年国内Tet抗肝纤维化研究也由此逐渐走向低谷.为减少毒副反应，拓展该药物的临床应用，我们近四年从降低Tet的单药剂量、联合用药及改造药物毒性基团等方面进行实验性探索。
新近，我们在国内外首次发现,低浓度Tet能上调转化生长因子β（transforminggrowthfactorfactorβ，TGF-β）抑制性信号分子Smad7表达,调控TGF—β-Smad信号通路，抑制体外培养静止期HSC活化，阻断TGF—β1促静止期HSC活化效应，Tet还诱导活化HSC活化逆转。
部分最新研究成果已经整理成文发表在本领域有一定影响力的SCI索引源期刊上,并被SCI收录（收录号IDSNumber:
963XN）［2]（相关文章参详见申请人简历及附件二、三）。
这些全新研究成果进一步增强了我们开发这一传统中药的信心。
TGF-β1是目前认识的最重要的促肝纤维化因子。
抑制TGF—β1对HSC的作用一直以来均是抗肝纤维化重要着眼点[3］。
Smad7是HSCTGF—β信号通路的最主要负反馈调节信号分子，上调Smad7是抑制TGF-β对HSC不良生物效应的有措施之一[4]。
在肝纤维化过程中，TGF-β信号通路还与整合素信号通路存在密切联系。
这表现在三个方面:
①XXXXXX。
②XXXXXX。
③XXXXXXXXX.
综上所述，XXXXXXX，如能XXXXXX，可进一步实现XXXXX治疗。
基于以上研究结果,我们研究室在国家自然科学基金资助下，过去三年中应用化学方法合成了RGD和M6P,并将RGD与M6P结合成一新型复合分子RGD—M6P，研究比较了它们对HSC靶向性及在抑制其功能中的作用（项目名称：
RGD修饰细胞生物信息调控分子和缀合基因的功能研究,编号：
30170412）。
我们的研究发现，RGD和RGD-M6P均可抑制HSC活化。
RGD在抑制TGF—β激活同时，还可阻止HSC与ECM结合，阻断整合素信号转导。
研究还发现，M6P能提高RGD作用于HSC的靶向性,增加其局部浓度，使RGD-M6P显示出较RGD更强的抑制作用［14]。
我们首次证实，新型复合分子RGD—M6P用于抗肝纤维化治疗，无论在对HSC靶向的特异性,还是多位点联合作用方面,都优于单一的含RGD序列的肽段或M6P（参见基金结题摘要，相关文章参见申请人简历及附件四）。
RGD—M6P新型复合分子的研制成功及其对HSC靶向与抑制功能的发现，有助于我们去研究更多的HSC靶向选择性高、局部作用强、系统毒性小的新型药物和（或）制剂,从而提高药物的疗效、减轻毒性反应。
结合我们对Tet药理作用的分子机制的研究结果，不难发现,XXXXXXXX。
基于以上系列研究基础与设想，紧跟国内外在制剂学方面的进展,我们拟设计XXXXXXXXXXX。
当前,受体调节药物靶向（receptor—mediateddrugtargeting）作为一种新型的给药系统受到人们的重视[16］.XXXXXXXXXXXXXXXXX。
迄今为止，尚未见到XXXXXXXXXXX。
结合国内外同行的研究报道与我们的研究基础，不难推断，XXXXXXXXXXXXXXXXX.
综上所述，我们拟在XXXXXXXXXX。
本研究将为XXXXXXXX等提供理论与实践基础.XXXXXXXXXX可以设想，如能取得预期效果,经过良好设计的基础研究后，这一XXXXXX应用于临床的时间不会太久,前景广阔。
参考文献
1FriedmanSL。
Mechanismsofdisease：
Mechanismsofhepaticfibrosisandtherapeuticimplications。
NatClinPractGastroenterolHepatol2004；
1
（2）：
98—105.
2ChenYW,LiDG,WuJX,etal.Tetrandrineinhibitsactivationofrathepaticstellatecellsstimulatedbytransforminggrowthfactor—betainvitroviaup—regulationofSmad7.JEthnopharmacol2005;
100（3）：
299—305。
3BreitkopfK，HaasS，WiercinskaE，etal.Anti—TGF-betastrategiesforthetreatmentofchronicliverdisease。
AlcoholClinExpRes2005;
29（11Suppl）：
121S-131S.
4DooleyS,HamzaviJ,BreitkopfK，etal。
Smad7preventsactivationofhepaticstellatecellsandliverfibrosisinrats。
Gastroenterology2003;
125
（1）：
178—91。
5LudbrookSB，BarryST，DelvesCJ，etal。
Theintegrinalphavbeta3isareceptorforthelatency—associatedpeptidesoftransforminggrowthfactorsbeta1andbeta3。
BiochemJ2003;
369（Pt2）:
311-8。
6AnnesJP，ChenY，MungerJS，etal.IntegrinalphaVbeta6—mediatedactivationoflatentTGF—betarequiresthelatentTGF—betabindingprotein—1。
JCellBiol2004；
165（5）：
723-34。
7XXXXXXXXXXXXXXXXX.
2项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题
2.1研究内容：
2.2.1XXXXX化学合成与鉴定，二硬脂酸磷酯酰胺XXXXXXXXXX合成与鉴定.
2.2.2不同类型脂质体的制备、技术参数优化、物理性质鉴定和脂质体药物包封率、载药量、配体结合率鉴定与提高。
2.2.3大鼠HSC分离培养,XXXXXXX修饰脂质体与肝星状细胞体外结合活性研究。
2.2.4XXXXX修饰XXXXXXXXX对肝星状细胞活化、增殖、XXXXXXX信号通路影响.
2.2.5XXXXXXXXX的药代动力学特征、组织分布特征和XXXXXXX研究.
2.2.6XXXXXXXX对胆总管结扎和CCl4大鼠肝纤维化防治作用。
2.2研究目标:
2.2.1研究构建XXXXXXXX，为抗肝纤维化药物新剂型开发提供新型靶向载体。
2.2.2研究XXXXXX对HSC生物活性影响及机制,为中西药结合肝纤维化双靶向、多靶点、协同治疗提供理论基础.
2.2.3研究XXXXXXXX体内HSC靶向性及防治实验性肝纤维化的有效性，为开发中药新剂型、提高药物在靶组织浓度、降低有效剂量、减轻副作用和提高疗效提供实践基础。
2。
3拟解决的关键问题：
2.3.1高药物包封率、高配体修饰率的稳定XXXXXXXX制备。
2.3.2放射性计数法测定XXXXXX与HSC结合活性，有效抑制HSC活化的剂量、时间参数等。
2.3.3XXXXXX体内HSC靶向性、抗肝纤维化效果比较与评价。
3拟采取的研究方案及可行性分析
3.1研究方案：
第一部分 XXXXX及XXXXX合成
（1）XXXXXX合成及鉴定
采用我们研究室建立的方法，化学合成XXXXXX。
应用XXXXXXXXXX.合成反应图示如下。
高效液相（HPLC）、质谱等方法鉴定合成产物纯度及分子量。
反应图（略）
（2）XXXXXXXXXXX
采用一步法合成.XXXXXXXXXXXX.合成反应图示如下。
高效液相（HPLC）和质谱分析法进物产物纯化与鉴定。
第二部分 长循环脂质体制备、鉴定与技术条件优化
（1）脂质体制备
采用经我们改良的逆相蒸发法制备.具体方法如下：
XXXXXXXXXX。
（2）性质鉴定
XXXXXXXXXXXXXXXX。
（3）均匀设计优化处方
根据实验结果及文献，确定影响包封率的主要因素。
以包封率为评价指标,采用二项逐步回归计算回归方程,并进行方差分析，优化条件。
第三部分XXXXX修饰长循环脂质体与HSC体外结合活性
采用两步胶原酶灌注和密度梯度离心法分离大鼠HSC，选择静止态和激活态的HSC,接种于6孔板上（细胞密度为5。
0×
105/mL）。
待贴壁后，1％胎牛血清DMEM培养过夜，细胞同步化。
（1）配体结合的浓度—效应关系
XXXXXXXXXXX。
（2）配体结合的时间-效应关系
XXXXXXXXXXXX。
（3）竞争抑制
XXXXXXXXXX.
（4）细胞荧光定位、配体表面结合率与内吞率测定
（5）平衡解离常数（Kd）和细胞最大结合位点数（Bmax）
第四部分XXXXXXX对HSC生物学特性影响与机制
采用酶法分离大鼠HSC.新鲜分离的HSC,体外培养48h后,作为静止期HSC用于下游实验,或培养1w后消化传代，继续培养24h后，作为活化的HSC用于下游实验。
（1）XXXXXXX对HSC活化状态影响
XXXXXXXXX。
（2）XXXXXX对TGF—β1效应影响
XXXXXXXXXXXX.
（3）XXXXXXXX大鼠HSCTGF-β受体XXXXXXX信号通路影响
XXXXXXXXXXXXXX。
第五部分XXXXXXXXXXXX
（1）XXXXXXXX在肝纤维化大鼠体内的器官分布
（2）XXXXXXX大鼠体内药代动力学
采用XXXXXXXX。
（3）XXXXXXX在肝纤维化大鼠肝脏内分布
采用XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX。
第六部分XXXXXXX防治大鼠肝纤维化
（1）造模
采用胆总管结扎和CCl4肝纤维化两种动物模型.
（2）分组及处理
（3）治疗效果检测
主要比较以下指标：
XXXXXXXXXXXXXXX.
3。
2技术路线
技术路线图（略）。
3.3可行性分析
3.1立项依据有坚实
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