蛋白质印迹法文档格式.docx

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分离后的蛋白质带有负电荷，因而用电转移的方法能有效地将蛋白质转移至固相载体上（如硝酸纤维素膜）。

用于承载蛋白质的各种膜均具有一个特点，它们都能与蛋白质发生非特异的共价结合，因而结合较为牢固，不易被后续的洗膜等操作洗脱.

Westernblotting所用的探针为针对靶蛋白某段氨基酸序列的抗体。

能直接与靶蛋白发生抗原抗体结合的抗体称为第一抗体（简称一抗），通常由于较难大量获得该抗体，使得对其进行标记很困难。

为此人们设计了能与一抗结合的抗体，成为第二抗体（简称二抗）。

二抗是将一抗的FC段作为抗原的，而每一物种的抗体FC段氨基酸序列都较为保守，这使得二抗能够大量生产，因而对二抗进行标记也就较为容易了。

二抗与一抗能通过抗原抗体特异性结合后，以一定的方法对二抗上的标记进行检测便可检出靶蛋白。

二、器材

电热水浴箱、玻璃匀浆器、冷冻离心机、滤纸、水平摇床、电转移装置、醋酸纤维素膜（NC膜）、电泳仪、试管、微量移液器、Tip头、Epp管（2ml、5ml、ml）

三、试剂配制：

1）、1.5MTris—Hcl,：

18.16gTris溶于60mlddH2O，用浓盐酸调节PH至，定容至100ml，4℃保存。

2）、1.0MTris—Hcl,：

12.12gTris溶于60mlddH2O，用浓盐酸调节PH至，定容至100ml，4℃保存。

3）、10％SDS：

10gSDS溶于90mlddH2O，轻柔搅拌，溶解后加水至100ml。

4）、10×

TBS（Trisbuffersolution）,：

24.2gTris，80gNaCl,溶于700mlddH2O用1MHCl（约15ml）调节pH至，加ddH2O至1000ml。

5）、TBS-T，：

前述TBS-T加Tween-20使浓度为％。

6）、5×

电泳缓冲液，：

15gTris,72g甘氨酸，5gSDS溶于1000mlddH2O，4℃保存。

（若有沉淀出现，用前加热至室温即可）。

7）、转移缓冲液（25mMTris、192mM甘氨酸、20％甲醇），：

3.03gTris，14.4g甘氨酸，200ml甲醇加ddH2O至1000ml。

（勿用酸碱调节pH）。

8）、10mMPMSF液；

异丙醇8ml，PMSF0.01742g溶解后定容至10ml。

（使用时按照10ml裂解液：

1ml10mMPMSF）

9）、裂解缓冲掖；

包含50mmol/L,150mmol/LNaCl,1％TritonX:

配置100ml的裂解缓冲掖，需称取Tris碱0.61g溶解于60ml双蒸水，用浓盐酸调节，然后加入NaCl0.88g,TritonX—1001ml,加水至总量为100ml。

10）、PBS800ml蒸馏水中加入NaCl18g，KCl0.2g,Na2HPO41.44g和KH2PO40.24g,用浓盐酸调节Ph至，定容至1L。

高压灭菌。

11）、10％过硫酸胺（APS）：

称取APS0.5g溶解于5mlddH2O中，分装保存于—20℃。

12）、1％溴酚蓝:

称取0.1g溴酚蓝溶解于10mlddH2O中,分装保存于4℃。

13）30%丙烯酰胺（Acr:

Bis=29:

1）:

称取丙烯酰胺（Acr）29g,甲叉丙烯酰胺（Bis）1g,用去离子水溶解并稀释至100ml,储存在棕色瓶中于4℃保存，可用1个月

13）、SampleBuffer:

总体积ml

ddH2O3.8ml

0.5MTris—Hclml

甘油ml

10％SDSml

?

-巯基乙醇ml

1％溴酚蓝ml

实验步骤：

1、样品制备：

小鼠禁食过夜，断头处死，迅速剖开腹腔，取出肝、肾分别称重

↓

按1g组织中加入冰预冷的10ml裂解液，10mMPMSF1ml冰上制成10％的组织匀浆

取1ml匀浆20000g，4℃、离心30分钟

小心吸取上清液

取少量上清液进行蛋白定量，余下的-20℃保存备用

2、蛋白质定量（考马斯亮蓝染色法）

考马斯亮蓝G—250是一种蛋白质染料，最大吸收峰在465nm,当它与蛋白质以范德华力结合形成考马斯亮蓝G—250蛋白质复合物，其最大吸收峰改变为595nm，其吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质含量的测定。

按下表操作。

表1

加入物空白管测定管

PBS150μl145μl

考马斯亮蓝染液

蛋白质提取液－5μl

摇匀，室温放置5分钟，空白调零，于595nm处比色

绘制标准曲线，计算测定管的浓度

3、制胶：

装配好制胶玻璃板

按下列配方配制12％的分离胶：

12％的凝胶溶液成分体积（总体积10ml）

ddH2Oml

30％丙烯酰胺溶液4ml

1.5MTris（）ml

10％SDS100μl

10％过硫酸胺（APS）100μl

TEMED4μl

将表中的前四项组分混匀后，再加入APS和TEMED。

将上述溶液缓慢注入制胶玻璃片至梳齿下1cm,操作中注意防止产生气泡，聚胶30分钟后用ddH2O完全洗净封闭液。

按下列配方配制5％的聚集胶：

5％的凝胶溶液成分体积（总体积5ml）

ddH2Oml

30％丙烯酰胺溶液ml

1.0MTris（）ml

10％SDS50μl

10％过硫酸胺（APS）50μl

TEMED5μl

注入聚集胶前，用滤纸吸干分离胶上的水。

缓慢注入聚集胶，过程中注意防止产生气泡。

插入梳齿，聚胶30分钟后小心拔除梳齿。

用ddH2O清洗梳孔，放入电泳槽备用。

4、样品处理：

用SampleBuffer按1：

1稀释样品

95℃加热变性5分钟

5、上样及电泳：

将电泳槽内注满1×

电泳缓冲液，彻底除去点样孔中和胶底的气泡。

两边空白的泳道点上等量的SampleBuffer，

上样量（20μl含40μg蛋白）

向电泳外槽内注入1×

电泳缓冲液，盖上盖子，电泳开始时电压为80V，染料进入分离胶后，将电压增加到120V，稳压，当染料抵达分离胶底部约80分钟，断开电源。

6、转膜：

剪6块滤纸和一块NC膜，其大小与胶相同

将滤纸预先在转移缓冲液中浸泡5分钟，除去气泡。

凝胶电泳完成后取出。

按照海绵→3块滤纸→凝胶→NC膜→另外3块滤纸→海绵的顺序依次放，应避免气泡。

用塑料支架夹紧上述各层，放入转移内槽及外槽，注入冰预冷的转移缓冲液。

注意NC膜一侧靠正极，胶一侧靠负极。

转移200mA稳流，4℃，小时。

7、封闭NC膜：

转移完成后，取出膜放在滤纸上，用铅笔标好正面，室温干燥数分钟。

用westernblotting封闭液封闭NC膜，

室温下振荡1小时后4℃过夜（NC膜正面向上）

8、一抗结合:

一抗用封闭液配制（按1：

20（CYP1A1）及1:

200（β-actin）配制）

室温振摇2小时（NC膜正面向上）

以TBS-T洗膜3次，每次5-10分钟

9、二抗结合：

二抗以TBS-T稀释（按1：

600配制）

室温振摇孵育小时（NC膜正面向上）

10、显色：

辣根过氧化物酶显色

1）在试管中先加入1ml×

HRP反应缓冲液，然后依次加入试剂A500μl、试剂B500μl、C500μl混匀即可。

2）配制好的溶液应避光存放，30min内使用，染色为褐色。

3）室温下染色时间为5～30min，可根据颜色变化掌握染色时间。

4）等目的条带显色后，用少量PBS清洗。

11、照相保存

（附：

CYP1A1的分子量为56Kda，β-actin的分子量为43Kda）

2011年研究生高级生化实验（WB）实验记录

姓名年月日

教师签字