生命科学生物技术大实验指导Word文件下载.docx

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高速低温高心机，Eppendorf离心管。

2.试剂

TRIzol试剂、氯仿、75%乙醇（% 

DEPC配制）、1% 

DEPC、异丙醇

四、操作步骤

所提取物为感染猪繁衍与呼吸综合征病毒的细胞中的病毒。

所用一切物品无RNA酶。

1.在的eppendorf管中加入病毒原液500l，再加入TRIzol溶液500l，充分混匀，室温放置10min。

2.加入200l的氯仿，盖紧离心管盖，使劲震荡离心管（溶液充分乳化，成乳白状，无分相现象），室温放置10min（由于氯仿沸点低、易挥发，振荡时离心管可能爆开，小心）。

3.离心4℃、13000r/min、15min，取上层液相移入另一管（切忌吸动白色中间相）。

4.加入等体积异丙醇，轻轻倒置离心管充分混匀液体，室温放置10min。

5.离心4℃、13000r/min、15min，小心吸去所有上清。

底部有RNA，操作需小心。

1ml75%乙醇洗一遍，离心4℃、8000r/min、10min。

小心吸去所有上清，在超净台中干燥5min。

6.加入适量DEPC处置水（建议当即做RT-PCR。

若要保留，可在上一步加入乙醇后冻存于－70℃，可保留一年；

若加入DEPC水后则只能在－20℃保留1个月左右。

）。

五、注意事项

1.操作时必需戴手套。

2.所用的器皿和试剂均须经DEPC水处置或250－300℃干烤4h。

3.Trizolreagent、氯仿、DEPC水是剧毒物质，要注意防护。

实验二逆转录反映

掌握RNA逆转录扩增cDNA的方式和原理

二、实验原理

RT-PCR是指将逆转录（ReverseTranscription；

RT）反映和PCR（PolymeraseChainReaction）反映组合在一路的方式。

RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成，它是一种分析基因表达的快速灵敏的方式。

RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。

另外，这项技术还能够用来检测基因表达不同而没必要构建cDNA文库克隆cDNA。

RT-PCR比其他RNA分析技术更灵敏，更易于操作。

RT-PCR的模板能够为总RNA或poly（A）+选择性RNA。

逆转录反映能够利用逆转录酶，以随机引物、oligo（dT）或基因特异性的引物起始。

RT-PCR能够一步法或两步法的形式进行。

在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。

cDNA的合成第一在逆转录缓冲液中进行，然后掏出1/10的反映产物进行PCR。

在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一尽管中按序进行。

三、实验仪器和试剂

1.仪器

PCR仪、离心机、灭菌的PCR管、移液器等

2.试剂

实验一中提取的总RNA；

随机引物及Oligo（dT）；

逆转录酶；

dNTP；

RNA酶抑制剂

四、实验步骤

1.在冰浴离心管里面加入模板RNA4L，引物2L，去离子水5L，混匀，离心3-5秒；

2.70℃水浴5分钟，冰浴30秒（此处是为了使引物和模板正确配对）；

3.加入5×

反映液4uL，RNase抑制剂1L，dNTP2L（这些应该先配好，然后分再装到每一管），混匀；

4.37℃水浴5分钟，加入1LAMV-RT反转录酶，混匀；

5.37℃水浴1小时（此步是反转录进程）；

6.70℃10分钟结束反映（此处是灭活酶活性，避免对后续实验产生干扰），产物置冰上进行下一步PCR实验，余下的-70℃保留。

1.在实验进程中要避免RNA的降解，维持RNA的完整性。

2.操作人员在实验进程中手套要勤换。

3.加入试剂之前，把它混匀一下，以避免放置时刻长了浓度不均。

实验三聚合酶链式反映

1.了解聚合酶链反映（PCR）的大体原理及其影响因素，

2.掌握PCR的大体操作进程。

聚合酶链式反映（polymerasechainreaction）即PCR技术，是一种体外扩增特定基因或DNA序列的方式。

PCR具有很高的特异性、灵敏度，在分子生物学、基因工程研究、某些疾病的诊断和临床标本中病原体检测等方面具有极为重要的应用价值。

双链DNA分子在接近沸点的温度下解链，形成两条单链DNA分子（变性），与待扩增片段两头互补的寡核苷酸（引物）别离与两条单链DNA分子双侧的序列特异性结合（退火、复性），在适宜的条件下，DNA聚合酶利用反映混合物中的4种脱氧核苷酸（dNTP），在引物的引导下，按5’至3’的方向合成互补链，即引物的延伸。

这种热变性、复性、延伸的进程就是一个PCR循环。

随着循环的进行，前一个循环的产物又能够作为下一个循环的模板，使产物的数量按2n方式增加。

从理论上讲，通过25-30个循环后DNA可扩增106-109倍。

影响PCR反映结果的因素较多，主要包括：

（1）模板的质量：

在制备模板DNA时通常需要利用蛋白变性剂及乙醇等有机溶剂，这些物质可直接影响PCR反映；

另外当模板DNA分子量很高时，解链不易，可用限制酶消化以改善扩增效果；

从理论上说，一个模板DNA分子即可取得扩增产物，模板浓度太高，PCR反映的特异性下降，实际操作中可按1ng、、递减的方式设置模板浓度对照。

（2）引物：

引物是决定PCR结果的关键，引物设计在PCR反映中极为重要。

要保证PCR反映能准确、特异、有效地对模板DNA进行扩增，通常引物设计要遵循以下几条原则：

①引物的长度以15-30bp为宜，一般（G+C）的含量在45-55%，Tm值高于55℃［Tm=4（G+C）+2（A+T）］。

应尽可能避免数个嘌呤或嘧啶的持续排列，碱基的散布应表现出是随机的。

②引物的3’端不该与引物内部有互补，避免引物内部形成二级结构，两个引物在3’端不该出现同源性，以避免形成引物二聚体。

3’端末位碱基在专门大程度上影响着Taq酶的延伸效率。

两条引物间配对碱基数少于5个，引物自身配对若形成茎环结构，茎的碱基对数不能超过3个由于影响引物设计的因素比较多，现常常利用运算机辅助设计。

③人工合成的寡聚核苷酸引物需经PAGE或离子互换HPLC进行纯化。

④引物浓度不宜偏高，浓度太高有两个短处：

一是容易形成引物二聚体（primer-dimer），二是当扩增微量靶序列而且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。

一般说来，用低浓度引物不仅经济，而且反映特异性也较好。

一般用较好。

（3）Mg2+浓度：

PCR反映体系中Mg2+浓度对扩增结果影响较大，一般是L，必要时可调整Mg2+浓度。

（4）dNTP浓度：

L，dNTP浓度太高，反映的特异性下降。

（5）反映条件：

PCR反映条件中最重要的是退火温度，退火温度低，引物容易结合到模板的靶DNA序列，但反映的特异性下降；

反之，特异性增加，但扩增效果不佳。

一些生物技术公司在合成引物时注明了Tm值，以此为依据，退火温度比Tm值低3-5℃比较适宜。

固然，在实际操作时可设置梯度以肯定最佳退火温度。

PCR仪、台式离心机、电泳仪、电泳槽、紫外检测仪

引物：

用去离子水配成10μmol/μl；

Taq聚合酶；

10×

PCR反映缓冲液（加镁离子）；

dNTPs：

四种核苷酸混合物（浓度为10mM）；

模板：

反转的病毒cDNA；

1%琼脂糖凝胶；

50×

TAE电泳缓冲液（1000mL）：

Tris242g、Na2EDTA·

2H2O37.2g，溶于600ml去离子水中，加冰乙酸ml，最后用去离子水定容至1000mL；

6×

上样缓冲液：

%溴酚蓝；

%二甲苯睛蓝，30%甘油，溶于水中，4℃保留。

1.反映混合液的配制：

在一个管中加入下列成份。

充分混匀，离心片刻，确保管壁上液体沉入底部。

两种引物（各）

1μl

PCR缓冲液

5μl

dNTPs（10mMeach）

模板

Taq酶

去离子水

补至50μl

2.PCR反映条件

循环1：

94℃，3分钟；

循环2-31：

94℃变性45s、52℃退火45s、72℃延伸1min；

共30个循环；

最后72℃延伸10分钟。

3.反映产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳分析。

1）用1TAE缓冲液配制琼脂糖凝胶：

在电子天平上准确称取琼脂糖0.2g，倒入100ml三角瓶，加入20mL缓冲液。

2）微波炉上加热40s。

3）待冷却至60℃左右时，加入1μLgoldenview，摇匀。

4）将凝胶倒入预先预备好的制胶板上，插入梳子，待冷却。

5）将PCR产物在１％琼脂糖胶上电泳：

80V，20min。

6）掏出凝胶，在紫外灯下观察，记录观察结果。

7）用手术刀切取大小正确的PCR产物，放入的EP管中。

4.PCR产物的纯化

1）加入胶重量3倍体积的溶液A，42℃下溶解胶，期间倒置几回增进其溶解。

2）加入1倍溶液A体积的异丙醇，混匀后移入PCR产物回收柱，6000rpm离心30秒，将滤过液再次加入回收柱，6000rpm离心30秒。

3）加入洗涤液500l，12000rpm离心30秒，弃去洗涤液。

4）重复步骤3一次。

5）换EP管，12000rpm下离心10min。

6）换EP管，在回收柱中膜的中央加入50ul去离子水，12000rpm下离心1min，取得纯化的PCR产物待用。

由于PCR灵敏度超级高，所以特别需要避免反映混合物受到DNA的污染，因此在实验中应注意下列事项：

1.所有与PCR有关的试剂，只作PCR实验专用，不得挪作它用。

2.操作中利用的PCR管、离心管、吸头等，只能一次性利用。

3.特别注意避免引物受到用同一引物扩增的DNA的污染。

所有试剂，包括引物，应从母液中取一部份稀释成工作液以供平常利用，避免污染母液。

实验四质粒DNA酶切、连接、转化、挑选、鉴定

1.学习和掌握限制性内切酶的特性

2.掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方式

3.掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方式

4.学习和掌握热击法转化的原理和方式

5.学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方式

重组质粒的构建需要对DNA分子进行切割，并连接到适合的载体上进行体外重组。

限制性核酸内切酶和DNA连接酶的发觉与应用，为重组质粒的构建提供了有力的工具。

限制性核酸内切酶酶切分离法适用于从简单基因组中分离目的基因。

质粒和病毒等DNA分子小的只有几千碱基，大的也不超过几十万碱基，编码的基因较