人子宫内膜异位症在位和异位内膜细胞原代培养及形态学观察Word格式.docx

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结果：

正常对照子宫内膜细胞及EM在位、异位子宫内膜细胞分离培养成功率分别为%、%和%。

EM异位、在位子宫内膜腺上皮细胞与正常在位子宫内膜腺上皮细胞大小相似，但EM异位子宫内膜腺上皮细胞染色质增多，核增大。

EM异位子宫内膜间质细胞较EM在位及正常在位子宫内膜间质细胞小，且细胞膜表面有较多的微绒毛和胞浆突起。

结论：

注意取材方式，采用改良原代培养方法，可以提高EM异位子宫内膜细胞培养成功率。

EM异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞超微结构与正常妇女及EM在位子宫内膜细胞有显著不同。

　　［关键词］子宫内膜异位症;

原代培养;

腺上皮细胞;

间质细胞

　　Primarycultureandmorphologicobservationofeutopicandectopicendometrialcellsfrompatientswithendomehiosis

　　ABSTRACTObjective:

Toexplorethemethodofprimarycultureforendometrioticcellsandtofindoutthedifferencesinmorphologicalmanifestationsamongendometrioticcellsandeutopicendometrialcellssampledfrompatientswithendometriosisandendometriosisfreewomen.Methods:

Endometrioticandeutopicendometrialcellswereculturedbymodifiedmethodofprimaryculture.Theendometrioticcelltypeswereobservedanddifferentiatedunderopticalandelectronmicroscopes.Results:

Thesuccessratesforcultureofeutopicendometrialcellsfromendometriosisfreewomenandpatientswithendometriosiswere%and%respectively.Thesuccessrateforcultureofendometrioticcellswas%.Thesizeofendometrioticglandularcellswassimilartothoseofeutopicendometrialglandularcellsfromendometriosisfreewomenandpatientswithendometriosis.Thechromatinwasmanifoldandthenucleuswasaugmentedintheendometrioticglandularcells.Theendometrioticstromalcellsweresmallerthantheeutopicendometrialstromalcellsfromendometriosisfreewomenandpatientswithendometriosis.Manytinyvilliandprotuberancesonplasmamembranecouldbeseenintheendometrioticstromalcells.Conclusion:

Thesuccessrateforcultureofendometrioticcellscanbeelevatedthroughimprovingthemethodofprimaryculture.Theultrastructuresofendometrioticglandularandstromalcellsareobviouslydifferentfromthoseofeutopicendometrialglandularandstromalcellsfromendometriosisfreewomenandpatientswithendometriosis.

　　KEYWORDSendometriosis;

primaryculture;

glandularcells;

stromalcells

　　子宫内膜异位症（endometriosis,EM）是子宫内膜间质细胞和腺上皮细胞种植于子宫腔以外的雌激素依赖性疾病，具有侵袭性生长、广泛种植、易复发等恶性肿瘤样特性。

虽然EM的发现已有一百多年的历史，但其病因尚不十分清楚，亦无有效的治疗方法。

因此，EM是目前妇科学界研究的热点之一。

已有的大量研究表明，异位子宫内膜间质细胞与腺上皮细胞的功能及相互作用不同于在位内膜［1,2］，而原代培养细胞由于刚离开机体，因此能较好地反映体内细胞的生物学特性，故原代培养已成为EM体外研究的一个重要方法。

实践表明，在位和异位内膜间质细胞及腺上皮细胞的分离培养成功率并不高，尤其是异位内膜细胞培养的成功率较低，故本研究对EM在位内膜细胞及异位内膜细胞的分离培养方法进行了探索，观察正常子宫内膜细胞、EM在位内膜细胞及EM异位内膜细胞之间形态学的差异，从细胞形态学角度研究EM的发病机制，以期为EM的研究提供有价值的体外细胞模型。

　　1材料与方法

　　材料

　　标本采集

（1）2002年12月～2003年7月在长海医院妇产科行手术治疗的EM患者共16例，年龄23～47岁，平均（±

）岁；

所有患者均无内科合并症，月经规律；

术前3个月内未服用激素类药物；

剖腹行全子宫切除术或子宫附件切除术后，分离子宫内膜、巧克力囊肿内皮及盆腔异位灶。

（2）因子宫肌瘤行全子宫切除术患者共12例，年龄23～47岁，平均（±

无内科合并症；

剖腹行子宫附件切除术后刮取子宫内膜。

　　主要仪器CO2细胞培养箱（德国Hereaus公司产品）；

SWCJ2F型净化工作台（江苏苏州安泰空气技术有限公司产品；

微量可调移液器（法国Glison公司产品）；

倒置相差显微镜（上海光学仪器厂产品）；

KA1000台式离心机和SH288型37℃恒温水浴摇床（上海安亭科技仪器厂产品）。

　　主要试剂F12培养基、达氏改良依氏培养基（Dulbecoo’smodifiedEagle’sMedium,DMEM）、谷氨酰胺（美国Gibco公司产品）；

Ⅳ型胶原酶、牛血清白蛋白、胎牛血清（美国Sigma公司产品）；

DNaseⅠ酶（华美生物工程有限公司产品）；

小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司产品）；

鼠抗人细胞角蛋白单克隆抗体、鼠抗人波形蛋白单克隆抗体（美国Santa公司产品）；

链霉菌抗生物素蛋白过氧化酶连接法（streptavidinbiotinperoxidase,SP）免疫组织化学试剂盒（美国DOKA公司产品）。

　　实验方法将组织标本用无菌F12/DMEM（FD）培养液冲洗后，按文献方法［3,4］经不断实践后改良进行分离培养操作。

具体实验步骤如下：

将子宫内膜标本用无菌生理盐水冲洗后，放入冰浴的FD培养液中。

用FD清洗后剪碎标本，加入FD培养液，再加入Ⅳ型胶原酶（终浓度为1mg/ml），37℃恒温水浴摇床中消化60min后，加入DNaseⅠ（终浓度为15U/ml），继续消化30min。

将消化后的组织吸入离心管中，700r/min离心7min，弃上清液，加入含10%胎牛血清的FD培养液，700r/min，离心7min，弃上清液。

加入FD培养液，用吸管将细胞吹打开，然后经100目（孔径150μm）和200目（孔径74μm）不锈钢细胞滤网依次过滤（在培养皿中进行）。

200目网上细胞团主要为腺上皮细胞。

将滤液（主要为间质细胞）经1000r/min离心7min，用适量FD培养液悬浮细胞。

制作%和%牛血清白蛋白（bovineserumalbumin,BSA）梯度，将间质细胞悬液铺于梯度层上，室温沉降20～30min。

弃去上层BSA液，用FD培养液洗涤1遍（1000r/min离心7min），将细胞按5×

105/ml的密度接种于含10%胎牛血清的FD培养液中，置于37℃5%CO2培养箱中培养。

用FD培养液冲洗200目滤网上的细胞（主要为腺上皮细胞），收集冲洗液，700r/min离心5min，弃上清，用适量FD培养液悬浮。

将细胞悬液铺于装有8mlFD培养液的15ml玻璃离心管中，重力沉降10min，弃上清，反复操作4次，使腺上皮细胞团沉降至底层。

用含10%胎牛血清的FD培养液悬浮腺上皮细胞团后，接种于玻璃培养皿中，待混杂其中的间质细胞贴壁，3h后吸出腺上皮细胞团，磷酸盐缓冲盐水（phosphatebufferedsaline,PBS）离心洗2遍（700r/min离心7min）。

用含%依地酸（edeticacid,EDTA）的%胰酶消化5min，使腺上皮细胞团分散成单个细胞，然后吸入离心管，700r/min离心7min。

将细胞接种于含10%胎牛血清的FD培养液中，置于37℃5%CO2培养箱中培养。

　　观察指标与方法

　　细胞类型鉴定细胞角蛋白（cytokeratin）广泛存在于人类上皮组织及培养的上皮细胞内，而波形蛋白（vimentin）则主要位于间质细胞中［5］。

所以分别选择鼠抗人细胞角蛋白单克隆抗体和鼠抗人波形蛋白单克隆抗体作为第一抗体，以SP染色法进行染色，对分离获得的子宫内膜两种细胞进行鉴定。

　　光学显微镜观察将无菌盖玻片放入六孔培养板中，消化分离后的间质细胞接种于六孔培养板盖玻片上，置于37℃5%CO2培养箱中培养。

从培养皿中取出间质细胞生长良好的载玻片，用PBS液洗去原培养液。

消化分离后的腺上皮细胞予以常规涂片。

间质细胞和腺上皮细胞用95%乙醇固定，常规HE染色，光学显微镜下观察。

　　细胞超微结构观察将消化分离的正常对照子宫内膜间质细胞及腺上皮细胞，EM在位和异位间质细胞及腺上皮细胞分别用%戊二醛和1%锇酸双固定，618环氧树脂包埋，LKBⅤ型超薄切片机切片，醋酸铀、枸橼酸铅双重染色，在ECNAI12型透视电镜下进行观察并摄像。

　　2结果

　　原代细胞分离培养情况分离培养的12份正常对照（子宫肌瘤）子宫内膜标本，成功11例，分离培养成功率为%；

分离培养的16份EM在位子宫内膜标本，成功15例，分离培养成功率为%；

分离培养的16份EM异位子宫内膜标本，成功12例，分离培养成功率为%。

　　细胞类型鉴定结果腺上皮细胞角蛋白染色大多数呈阳性反应，细胞纯度达85%；

间质细胞波形蛋白染色呈阳性反应，细胞纯度达80%，经1次传代后，纯度可达85%以上。

见图1。

　　细胞形态学观察结果

　　光学显微镜观察

（1）腺上皮细胞：

正常对照、EM在位