实验室常用液体配制标准操作规程Word文件下载.docx

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每1000mL加分析纯NaCl10g，蛋白胨10g，酵母粉5g，用ddH2O配制，再用10MNaOH调pH至（1000mL一般加450ul），高压蒸汽灭菌15min冷却后使用。

2、固体培养基:

LB培养基中加入琼脂至％，高压蒸汽灭菌15min后使用。

3、10%（g/V）氨苄青霉素钠（Ap）：

注射用氨苄青霉素钠（粉末）50g溶于500ml无菌去离子水中，溶解后分装入4ml灭菌的EP管，全程超净工作台内操作，避免染菌，分装后－20度保存，培养细菌时做1000×

使用。

注：

如果购买的氨苄青霉素粉末不是无菌包装的，溶解后需用滤膜过滤除菌后再分装。

4、%（g/V）硫酸卡那霉素（Kan）

注射用硫酸卡那霉素（液体）通常是2ml/支，内含卡那霉素。

取25支药剂（50ml），加入450ml无菌去离子水中，分装入4ml灭菌的EP管，全程超净工作台内操作，避免染菌，分装后－20度保存，培养细菌时做1000×

如果购买的卡那霉素是粉末状的非无菌包装，溶解后需用滤膜过滤除菌后再分装。

5、细菌培养：

配制相应抗性培养基，每试管倒入3~4ml培养基（卡那霉素抗性培养采用标记试管），无菌牙签挑取单克隆至试管中，于37℃，220rpm培养。

剩余培养基做好抗性和日期标记，置于4℃保存。

6、化学感受态制备：

1）原理:

：

细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态，这时的菌细胞称为感受态细胞（Competentcell）。

将细菌置于0℃，低渗CaCl2溶液中时，菌细胞壁和膜的通透性增强，菌体膨胀成球型。

外源DNA与Ca2+形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，在经42℃短暂的热冲击处理（一般热休克90s）后能促进细胞吸收外源DNA复合物。

2）仪器、材料与试剂：

①超净工作台、低温离心机、摇床、-80℃冰箱，装液氮的泡沫盒及液氮、50ml的离心管2个，50ml的注射器及小过滤器各1个。

高压灭菌的纸张、透气膜、的EP管约350-500个，两块10cm的平皿板及接种环。

②TB缓冲液：

每200ml液体中含、、Kcl、PIPES。

（注：

在电子天平上的误差<

50mg,因在PH=易溶故先将其它药品用超纯水溶解,并用KOH及HCL调PH至。

在加入溶解后用超纯水定溶至相应的量，采用50ml的注射器及小过滤器过滤,一般储存在-20℃,时间<

25天,否则易被氧化颜色呈粉红。

）

③LB液体培养基：

参见前面介绍。

④LB固体培养基：

⑤1管DH5α的菌种

3）步骤：

①倒无抗性的固体培养板，用接种环沾取感受态甘油菌画线,置于37℃恒温培养箱中培养过夜。

②在超净台里采用小枪尖挑取培养板中的单克隆菌（菌落的大小约2~3mm）转接于200~250ml的LB液体培养基中,盖上透气膜。

③置于摇床上，18℃、200-250rpm速度摇约需3~5天，使OD600=~（对数生长期或对数生长前期）时开始制备。

④取出TB缓冲液及无菌的50ml离心管置于4℃冰浴中，预冷低温高速离心机（4℃、2500rpm、10min）。

⑤在50ml的离心管中加入约35ml-45ml的菌液，在4℃中冰浴10min。

⑥取出后放置于离心机上离心4℃、2500rpm、10min。

⑦弃上清液，在灭过菌的吸水纸上扣干（可重复多次收集菌体），先用约5~15ml的TB缓冲液重悬，再加至35ml的量（在冰上操作）冰浴10min。

⑧重复⑥+⑦的步骤一次。

⑨在35ml的TB缓冲液重悬后缓慢加入终浓度为7%的DMSO，混匀后在冰上冰浴10min。

⑩分装成100-150ul/管（的EP管）浸入液氮中速冻，分装约300多管后转移放置于-80℃冰箱保存。

4）转化效率的评估：

①采用小量质粒快转（冰浴10min→42℃热休克90s→冰浴2min→加无抗性LB液体培养基200ul→37℃摇床复温培养30min）。

②涂Kn、AP抗性板并做阴性对照（采用ddH20代替鉴定用的大提标准质粒），可以评价出是否有染菌、突变、转化效率。

③可以用Er2566等感受态做平行对照，评估其的生长快慢情况及转化效率的高低。

转化效率=转化子总数/质粒DNA加入量（1ug/ul）,标准质粒为大提用的N31-EGFP。

5）注意事项：

①严格按照标准操作步骤，整个操作过程要注意温度（4℃冰上操作）且洁净的超净台环境防止污染。

②直接从-80℃取出的菌株培养致敏后比连续使用或4℃短期保存的细菌的转化率要高，一般是受体菌应处于对数生长期或生长前期即OD600=~。

③转化鉴定时，42℃准确热休克90s不要振荡，迅速置于冰上2min,按照标准操作步骤进行评估。

一般是感受态制备好在-80℃冰箱冻存2天后再做鉴定，更准确评估。

④质粒分子量的大小对转化效率也有影响，一般来说，随着质粒分子量的增大，其转化效率会相应地降低。

但当质粒在~时，所得的转化率基本一致。

7、电转感受态制备：

1）准备工作：

（提前一天）

1、250mlLB液体盛于1L三角瓶中；

2、1L超纯水；

500mL离心管两支；

10%甘油400mL；

3、离心管和200ul枪头若干

以上物品，120℃灭菌20分钟后置于4℃保存备用

4、电转杯经纯水洗净后这置于75%乙醇浸泡

5、挑ER2738菌单克隆，接种于4mlTet抗性的LB中，于37℃190rpm过夜振荡培养。

2）感受态制备：

1、取前一夜扩增的菌液3ml接种于250mlTet抗性LB中，37℃240rpm振荡培养，约2-3小时OD值可达（其间每1小时测一次OD，其值在之间均可，但在时效率最好）；

2、将菌液置于冰水混合物中冷浴30分钟。

同时将前一夜置于4℃保存的物品取出，置于冰水混合物中冷浴30分钟，同时将离心机预冷到4℃；

3、将菌液全部转入500ml离心管中，2500rpm，4℃离心10分钟；

4、弃上清，向离心管中加入约100ml预冷的无菌水，在冰水混合物中摇晃瓶身，使沉淀充分悬起，然后再补加200ml无菌水，与离心机中4000rpm，4℃下离心10分钟；

5、重复步骤4两次；

6、以10%甘油代替无菌水重复步骤4一次；

在离心的过程中将离心管插入冰中预冷；

7、充分弃上清，加入200ul10%甘油，要换瓶身，使沉淀充分悬起，用预冷的枪头按100ul/支分装细胞于离心管中；

8、将分装好的细胞放入-80℃保存。

3）质量控制：

将电转杯从乙醇中取出，置于超净台中，用无菌风吹4小时

从-80℃取出一支感受态，立即放入冰盒里；

取1ul标准质粒（1ug/ml）加入感受态中，混匀后，加入预冷的电转杯中；

将电转条件设为，电击2-3秒，立即加入1mlSOC培养基并混匀；

将混合物转入离心管中于37℃，200rpm振荡恢复半小时；

用LB将培养物稀释至103涂于Amp固体培养基上，倒置于37℃温箱中，过夜培养。

计算效率：

效率=菌落数×

103×

103。

二、DNA操作系统

1、溶液I:

葡萄糖50mmol/L，EDTA10mmol/L，Tris-HCl25mmol/L，。

2、溶液II:

NaOHL，SDS1%，用ddH2O现配现用。

3、溶液Ⅲ:

取5mol/LNaAc60mL，冰乙酸，混合后加ddH2O至100mL。

4、酚-氯仿-异戊醇（25:

24:

1）

以25：

24：

1的比例混匀平衡酚、氯仿、异戊醇，保存于棕色玻璃瓶中，上覆一层Tris-Cl水相，4℃储存备用。

5、TE缓冲液:

10mmol/LTris-Cl，1mmol/LEDTA，灭菌后使用。

实验室中配有100×

的TE母液，用时可用ddH2O稀释成1×

使用液，灭菌后使用。

6、LCaCl2:

在适量纯水中溶解54g，定容至100mL，高压除菌后保存于4℃备用。

7、10×

DNA上样buffer：

母液：

以500ml为例：

蔗糖：

200g，溴酚蓝：

，取去离子水定容至500ml，完全溶解后放置于4℃保存。

*该母液配制完正常颜色为棕红色，颜色与pH值有关；

存储时间较长，每次使用时需摇匀，并注意是否长菌。

染料：

SYBERGreenI（MolecularProbe）10,000×

每次取50ul染料加入50ml母液中，充分摇匀。

分装于避光管中，即为10×

DNA上样buffer，配制好的buffer均需避光4℃保存。

*配制者需督促使用者及时将避光管放回4℃，并经常检查溶液存量，染料需提前订购。

8、RNaseA（DNasefree）：

RNaseA干粉（Ameresco）溶解于L的CH3COONa（pH）中，使终浓度为1mg/ml，加热至100℃，15min，室温冷却。

用体积的1MTris-Cl调pH至后，分装，于-20℃冻存。

*500ul/管分装，供分子克隆实验使用；

3ml/管分装，供大提质粒使用。

RNaseA干粉需提前订购，及时检查使用情况。

三、蛋白质操作系统

（一）、电泳

1、30%丙烯酰胺

将29g丙烯酰胺和1gN，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中，于磁力搅拌器上搅拌至完全溶解。

补加水至终体积为100ml。

以μm孔径过滤溶液，去除不溶性杂质。

查证该溶液的pH值应不大于，置棕色瓶中保存于室温。

注意事项：

丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。

称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。

可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料。

2、Tris-HCl

400ml水中溶解Tris-Base,浓盐酸调PH至后定容至500ml

3、Tris-HCI

4、10%SDS

900ml水中溶解100g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节pH值至，加水定容至1L，分装备用。

5、10％过硫酸铵

称取过硫酸铵2g，适量水溶解后，定容至20mL，分装成1mL/管，于-20℃保存备用。

6、蛋白上样Buffer（6×

蛋白加样缓冲液）

称取十二烷基硫酸钠12g、溴酚蓝，1MTris-Cl（pH=30ml、甘油60ml、β－巯基乙醇5ml，定容至100ml。

7、蛋白质电泳buffer（5×

称取三羟甲基氨基甲烷、甘氨酸、十二烷基硫酸钠,在水中溶解并定容至1L。

（二）染色

1、染色液（考马斯亮蓝染液）

甲醇45％，冰乙酸10％，去离子水45％，加考马斯亮蓝R-250或G-250至%，过滤后使用。

2、10×

脱色液

称取KCl，加水定容至1L

3、蛋白快速银染所需溶液

（1）固定液：

400mL甲醇，500uL甲醛，加水定容至1L；

（2）20%AgNO3溶液：

20gAgNO3加水定容至100mL；

（3）Na2S2O3溶液:

Na2S2O3·

3H2O,加水定容至1L；

（4）显色液（未加甲醛）：

30gNaCO3,20mL上述Na2S2O3溶液，加水定容至1L，（临用前加入甲醛，甲醛量如何确定？

）。

（5）柠檬酸：

C6H8O7·

3H2O,加水定容至1L。

（三）杂交

1、电转液：

称取Tris－Base，甘氨酸，