化妆中限制用的物质检测手段12页word文档Word文档格式.docx

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一研究目标

“教书先生”恐怕是市井百姓最为熟悉的一种称呼，从最初的门馆、私塾到晚清的学堂，“教书先生”那一行当怎么说也算是让国人景仰甚或敬畏的一种社会职业。

只是更早的“先生”概念并非源于教书，最初出现的“先生”一词也并非有传授知识那般的含义。

《孟子》中的“先生何为出此言也？

”；

《论语》中的“有酒食，先生馔”；

《国策》中的“先生坐，何至于此？

”等等，均指“先生”为父兄或有学问、有德行的长辈。

其实《国策》中本身就有“先生长者，有德之称”的说法。

可见“先生”之原意非真正的“教师”之意，倒是与当今“先生”的称呼更接近。

看来，“先生”之本源含义在于礼貌和尊称，并非具学问者的专称。

称“老师”为“先生”的记载，首见于《礼记?

曲礼》，有“从于先生，不越礼而与人言”，其中之“先生”意为“年长、资深之传授知识者”，与教师、老师之意基本一致。

随着食品化妆品监督功能的转移，化妆品中药物非法添加（限用禁用物质）受到越来越多的关注。

本课题在我国传统的化妆品安全卫生化学检测方法基础上，加入现代化的仪器分析手段来提高分析方法的灵敏度、选择性和准确性。

初步建立化妆品中限用禁用物质的检测方法体系，为化妆品中限用禁用物质的快速检验和定性定量分析、标准方法的制定提供技术支持。

（1）我国现行化妆品标准规范

目前有GB7916-1987《化妆品卫生标准》、GB7917-1987《化妆品卫生化学标准检验方法》、GB7918-1987《化妆品卫生微生物标准检验方法》、GB7919-1987《化妆品安全性评价程序和方法》等化妆品国家标准42个。

卫生部出台了《化妆品卫生规范》（2019年版）和《卫生部化妆品检验规定》2个。

新版的《化妆品卫生规范》（2019年版）于2007年7月1日正式执行。

（2）化妆品卫生安全问题及隐患

我国《化妆品卫生规范2019年版》制定的化学指标分析方法只有22个标准仅涉及57项,新版的《化妆品卫生规范》（2019年版）参考了欧盟对化妆品原料要求的有关规范，明显增加了禁用化学物质的种类和数量，化学类禁用物质1208项、植物类禁用物质78项、限用物质73项、限用防腐剂56项、限用防晒剂28项、限用着色剂157项。

但其中明确有卫生化学检验方法的只有76项，总的方法覆盖率仅为4.8%。

二研究结果

参照欧美同行化妆品执行标准,根据不同类别化妆品中禁用限用物质的性质，大力开展检测标准方法的研制,研究并扩大检验方法中禁限用物质的检测技术，加快检验方法的标准化进程。

1美白祛斑产品中过氧苯甲酰非法添加的分离测定（HPLC-DAD）

过氧苯甲酰作为药品可用于寻常痤疮的局部治疗，有报道称某些不法生产厂商为谋取利益在化妆品中非法添加此类物质。

我们采用二元梯度洗脱方式对其进行分离测定进行研究，有效地避免化妆品基质和其他活性成分的干扰。

采用C18色谱柱，乙腈-水-36%醋酸（70:

30:

0.1）为流动相，在238nm处，取过氧化苯甲酰对照品（从冰箱中取出后在室温下放置约1小时）约480mg，精密称定，置100ml量瓶中，加溶剂[乙腈-水（70:

30）]40ml，超声助溶，放冷用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液（对照品储备液要在使用当天新配）精密量取对照品储备液适量，用溶剂稀释100倍，作为对照品溶液。

取化妆品约1.0g，精密称定，精密加入乙腈10ml，超声助溶，放冷，冷冻，离心，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

过氧苯甲酰在0.5-65μg/ml浓度范围内呈良好线性，相关系数为0.99996，加样检出浓度为0.28μg/g,回收率为91%。

采用此方法对百余批样品进行了检测，分离良好，结果满意。

2化妆品中抗生素及甲硝唑的快速高效液相色谱测定法研究

建立了祛痘除螨类化妆品中8种抗生素及甲硝唑同时测定的快速高效液相色谱分析方法。

以Agielent1200快速高效液相色谱，采用SB和XDB-C18（1.8μm,4.6mmi.d.×

50mm）色谱柱，0.1mol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调节pH为2.5）-乙腈为流动相进行梯度洗脱，在7分钟内首次实现了8种抗生素及甲硝唑的同时分离测定，常规液相色谱分离至少需要30分钟才能完成一次分析。

在4～100μg/mL线性范围内，9种物质的线性相关系数均＞0.9999，最低检出限为0.25～1.4ng。

在低中高三个添加水平，9种物质的平均回收率为92.2%～103.2%，相对标准偏差为0.04%～4.5%。

并考察了不同状态的化妆品样品的提取方式。

该法操作简便、准确、快速，能够检测祛痘除螨类化妆品中8种抗生素以及甲硝唑的含量。

文献查阅及市场调查表明，抗生素类及某些激素因对痤疮有一定的治疗效果而常用于外用药中，如甲硝唑、氯霉素、林可霉素等。

我国《化妆品卫生规范》、欧盟化妆品规程（CoucilDirective76/768/EEC）规定抗生素类物质禁止在化妆品中使用。

目前，我国《化妆品卫生规范》（2019年版）已于2007年8月1日正式执行，其中首次提出了化妆品中五种四环素类抗生素及甲硝唑、氯霉素的标准检测方法。

原永芳等采用高效液相色谱法测定了护肤粉刺霜中的甲硝唑、氯霉素、地塞米松磷酸钠及维甲酸等成分。

王蕾等采用高效液相色谱法测定了药品中的四环素类抗生素。

本文建立了化妆品中8种抗生素，即盐酸米诺环素、盐酸土霉素、盐酸四环素、盐酸金霉素、盐酸多西环素、氯霉素、林可霉素、克林霉素和甲硝唑9种禁用物质的快速高效液相色谱检测方法，并采用此方法对市场上的祛痘除螨类产品进行了测定。

1）实验部分

（1）仪器与试药

Agilent1200高效液相色谱仪，包括真空脱气机（G1379B）、二元梯度泵（G1312B）、二极管阵列检测器（G1315C）、自动进样器（G1367C）、柱温箱（G1316B）、AgilentChem化学工作站。

Fresco17高速冷冻离心机（ThermoElectron公司），Kudos超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司），Vortex-genie涡旋振荡器（ScientificIndustries），SartoriuspH计。

Milli-QAdvantageA10（锋锐型）超纯水系统（密理博中国有限公司）

磷酸二氢钾为分析纯、磷酸为优级纯（上海化学试剂公司），水为蒸馏水，乙腈为色谱纯（Merck公司）。

盐酸米诺环素、盐酸土霉素、盐酸四环素、盐酸金霉素、盐酸多西环素、氯霉素、甲硝唑和林可霉素、克林霉素由中国药品生物制品检定所提供。

化妆品有各种祛痘洁面乳，激白抗痘骨胶原精华面膜，抗痘美白洁面乳，粉刺王精华等。

（2）色谱条件及实验方法

采用XDBC18色谱柱（50mm×

4.6mmi.d.,1.8μm），以0.1mol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调节pH为2.5）-乙腈为流动相进行梯度洗脱，流速为1.0ml/min，采用二极管阵列检测器，检测波长为268nm（在210nm波长处检测克林霉素和林可霉素），柱温为26℃;

进样量:

5μL。

（3）标准溶液的制备

分别准确称取盐酸米诺环素、土霉素、盐酸四环素、盐酸金霉素、盐酸多西环素、氯霉素、甲硝唑、林可霉素和克林霉素，置50mL容量瓶中，用0.1mol/L磷酸二氢钾溶液（pH2.5）溶解并稀释至刻度，摇匀，配成各组分质量浓度为0.4mg/mL的混合标准储备液。

标准曲线：

准确移取不同体积的混合标准溶液，用流动相稀释成各组分质量浓度为0、4、8、20、40和100μg/mL的系列标准溶液。

在设定色谱条件下，分别取5μL进样。

以系列标准溶液质量浓度为纵坐标，峰面积为横坐标，绘制标准曲线。

图18种抗生素和甲硝唑的标准色谱图（210nm）

1：

甲硝唑2：

林可霉素3：

盐酸米诺环素4：

土霉素5：

盐酸四环素6：

盐酸金霉素；

7：

克林霉素8：

盐酸多西环素9:

氯霉素。

快速液相色谱，XDBC18色谱柱（50mm×

4.6mmi.d.,1.8μm），以0.1mol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调节pH为2.5）-乙腈为流动相进行梯度洗脱，流速为1.0ml/min，柱温为26℃；

进样量:

5μL

图28种抗生素和甲硝唑的标准色谱图（268nm）

图3常规液相色谱上6种抗生素和甲硝唑的标准色谱图（268nm）

C18色谱柱（250mm×

4.6mmi.d.,5μm），以0.01mol/L草酸盐溶液（pH为2.0）-乙腈为流动相进行梯度洗脱，流速为1.0ml/min，柱温为30℃;

10μL。

与快速液相相比，分离所需时间长，基线无快速液相平

（4）样品溶液的制备

准确称取1.0g左右样品于50ml具塞刻度管中，加入0.1mol/L磷酸二氢钾溶液（pH2.5）10ml，振摇，超声提取30分钟，必要时加入石油醚10mL萃取，取下层离心，经0.45μm滤膜过滤，取续滤液作为待测样液备用。

在设定色谱条件下，分别取5μL进样分析。

根据峰面积，于标准曲线得出各组分的质量浓度，并根据稀释倍数计算实际样品中各组分的最终浓度。

2）结果与讨论

（1）色谱条件的选择

考察了不同流动相对9种物质分离的影响。

按照《化妆品卫生规范》色谱条件采用甲醇-乙腈-0.01mol/L草酸盐（pH2.0）（11:

22:

67）为流动相，采用多种品牌C18色谱柱（250mm×

4.6mmi.d.,5μm）进行实验，均未能达到甲硝唑、盐酸米诺环素、土霉素、盐酸金霉素、盐酸四环素、盐酸多西环素、氯霉素的同时有效分离，并且溶解稀释样品用流动相中的草酸盐还会干扰第一个色谱峰的检测。

实际工作中必须采用0.01mol/L草酸盐（pH2.0）与前述流动相进行梯度洗脱，才能实现上述物质及溶剂中草酸盐的有效分离。

但该条件下无法检测林可霉素和克林霉素，因为草酸盐在210nm处噪声太大，使得两者淹没在噪声中，无法检测。

故考虑采用磷酸盐系统并使用填料颗粒度更小的色谱柱。

色谱柱填料颗粒度越小柱效越高,不同的颗粒度有各自最佳柱效的流速；

而更小的颗粒度使最高柱效点向更高流速（线速度）方向移动，而且有更宽的线速度范围。

所以降低颗粒度不但能提高柱效，同时还能提高分析速度。

采用亚二微米的SBC18快速液相色谱柱，使得上述9种物质的同时快速分析成为可能。

我们考察了不同比例的甲醇-乙腈-磷酸盐等多种流动相，采用甲醇-乙腈-0.01～0.05mol/L磷酸盐（11:

67）,甲硝唑、盐酸米诺环素和林可霉素无法实现有效分离，克林霉素和多西环素亦无法完全分离。

选择乙腈-0.1mol/L磷酸盐（pH2.5）进行梯度洗脱，实现了9种物质的有效分离。

前0.8分钟乙腈-0.1mol/L磷酸盐（pH2.5）为13:

87，0.9-4.5分钟乙腈-0