微生物实验指导Word文档格式.docx

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显微镜的分辨率是指显微镜能分辨两点间最小距离（D）的能力。

D值愈小则表明分辨率愈强。

D值可用如下下公式表示：

D=0.610.610.61

λ

NA

式中入=光波波长；

NA=物镜的数值孔径值。

分辨率取决于物镜的数值孔径和光源波长，即显微镜分辨率与物镜的数值孔径成正比，与光波波长成反比。

波长愈短，数值孔径愈大，分辨距离愈短，则分辨能力就愈强。

光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（400～770nm），虽然利用紫外线作光源可提高分辨率，但应用范围有限，只适用于显微镜摄影而不适用直接观察。

数值孔径则取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率，即指介质的折射率与镜口角1/2正弦的乘积，可表示为：

a

NA＝n﹒sin

2

式中n=物镜与标本间介质的折射率；

a=镜口角（通过标本的光线延伸到物镜前透镜边缘所形成的夹角图1-1）。

图1-1物镜的镜口角

影响数值孔径的因素之一是镜角口。

式中a为光线最大入射角的半数。

它取决于物镜的直径和焦距。

当Sin（a/2）增到最大时，a/2=90°

，就是说，进入透视镜的光线与光轴成90°

角，这是不可能的，所以Sin（a/2）的最大值总是小于1。

现在所用的油镜其a/2为60°

左右。

影响数值孔径的另一因素是介质的折射率，前面已说到，不同介质的折射率是不同的，空气的折射率为1.0，水的折射率为1.33，香柏油的折射率为1.52，玻璃的折射率为1.55。

因此，在物镜和玻片标本间加入香柏油作介质时，数值孔径就可以增大到1.2—1.4。

人们肉眼所能感受的光波平均长度为0.55μm，假如数值孔径NA=0.65高倍物镜，能分辨两点之间的最小距离为0.42μm，而小于0.42μm的两点之间距离就分辨不出，而使用数值孔径NA=1.25油镜，能分辨两点之间的最小距离=0.552×

1.25=0.22μm。

因为不论总放大倍数多大，用普通光学显微镜是无法观察到小于0.2μm的物体。

但是大部分细菌直径在0.5μm左右，故用油镜就能清晰地观察到细菌的个体形态及某些结构。

显微镜的总放大率是指物镜放大率和目镜放大率的乘积。

但由于物镜和目镜搭配不同，其分辨率也不同，例如，在总放大率相同情况下，采用数值孔径大的40×

物镜和10×

目镜相搭配，其分辨率就比数值孔径小的20×

物镜和20×

目镜相搭配的要高些，效果也更好。

三、实验器材

1.标本：

细菌三型玻片。

2.试剂：

香柏油、显微镜清洗液（酒精乙醚液）。

3.器具：

显微镜（有油镜）、擦镜纸等。

四、操作步骤（用油镜观察细菌）

显微镜观察时，应遵守从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序，因为低倍镜视野相对大，易发现目标及确定检查的位置。

1.放置标本将染色的细菌三型玻片置于镜台上。

2.找合适的视野先用低倍镜寻找合适的视野，并将欲观察的部位移到视野中央。

3.转换油镜将油镜转到工作位置。

4.调节聚光器与油镜数值孔径一致只要将聚光器上升到最高位置，可变光阑开到最大，此时两者的数值孔径即达到一致。

5.加香柏油取香柏油1-2滴加到欲观察部位涂片上，从侧面注视然后将油镜转到工作位置，下降镜筒或上升载物台，使油镜浸入香柏油中。

必须十分注意，油镜头不能压在玻片标本上，下降镜筒或上升载物台也不能用力过猛，否则不仅会压碎玻片，还易损坏镜头。

6.调焦左眼从油镜中观察，同时转动粗调节螺旋，缓慢地提升油镜调焦，至出现模糊的物象时，再用细调节螺旋调节至物象清晰为止。

如按上述操作还找不到目的物，则可能是由于油镜下降不到位，或因油镜上升太快，以至眼睛捕捉不到一闪而过的物象。

遇此情况，应重新操作。

调焦时，应特别注意误将粗调节器向反方向转动而损坏镜头及玻片。

7.观察仔细观察细菌的三种基本形态。

8.显微镜用毕后的处理上升镜筒，取下玻片，清洁油镜，先用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，再取擦镜纸蘸取酒精乙醚液，擦去镜头上残留的油迹，然后再用干净的擦镜纸擦去残留物。

最后将镜头转至“八”字形，并将载物台和聚光镜降至最低处，将显微镜放入镜箱。

五、注意事项

1.油镜工作距离短，故操作时要特别谨慎，切忌用眼睛对着目镜边观察边下降镜筒，而应从侧面注视，不要使油镜镜头压在玻片标本上，下降镜筒或上升载物台也不能用力过猛，还应特别注意误将粗调节器向相反方向转动而损坏镜头和玻片。

2.切忌用手或其他纸擦拭镜头，以免使镜头沾上污渍或产生划痕，影响观察。

实验二细菌革兰氏染色和芽孢染色法

1.革兰氏染色法

革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种重要鉴别染色法。

1884年由丹麦病理学家C·

Gram创立，用革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类。

一般来说，芽孢杆菌与绝大多数球菌以及所有的放线菌和真菌都是革兰氏阳性反应；

弧菌，螺旋体，某些球菌和大多数致病性的无芽孢杆菌都是革兰氏阴性反应。

革兰氏染色法的基本步骤是先用结晶紫进行初染，再用碘液媒染（以增加染料与细菌的亲和力，使结晶紫和碘在细胞膜上形成相对分子质量较大的不溶于水的复合物，然后用脱色剂（乙醇或丙酮）脱色，最后用复染剂（如番红）复染。

凡细菌不被脱色而保留初染剂（蓝紫色）者为革兰氏阳性菌；

如果细胞中初染剂被脱色后而使细菌染上复染剂的颜色（红色）者则为革兰氏阴性菌。

革兰氏染色法之所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类细菌的细胞壁成分和结构不同所决定的。

革兰氏阳性细菌的细胞壁中肽聚糖层较厚且交联度高，类脂含量少，用乙醇脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，通透性降低，从而使结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经复染后，仍保留初染剂的蓝紫色。

而革兰氏阴性菌由于细胞璧中含有较高的类脂，而且肽聚糖层较薄，且交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时，溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使结晶紫和碘的复合物比较容易洗脱出来，结果是细菌被脱成无色，当用复染剂番红复染后，细菌就染成复染剂番红的红色。

2.芽孢染色法

芽孢是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常呈圆形或椭圆形，细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、大小和在菌体内的位置都是鉴定细菌的重要依据。

细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能是菌体着色而芽孢不着色。

芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色而一旦着色后又难以脱色这一特点而设计的。

芽孢染色法的基本原理是：

用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红,在加热条件下，延长染色时间促进标本着色，使染料不仅进入菌体也可以进入芽孢内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色就难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂如番红复染后，芽孢仍保留初染剂的绿色，而菌体则被染成复染剂的红色，使芽孢和菌体形成鲜明的对比，因而更明显地衬托出芽孢，易于辨认。

1.菌种:

大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）,金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus），枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis），巨大芽孢杆菌（Bacillusmegaterium），丙酮丁醇梭菌。

草酸铵结晶紫染色液，卢戈氏碘液，95%乙醇，番红复染液（附录Ⅰ）；

5%孔雀绿染色液，0.5%番红水溶液。

显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、镊子、木夹、香柏油、酒精乙醚液、擦镜纸、吸水纸等。

1.革兰氏染色成败关键是脱色时间，如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被误认为是革兰氏阴性菌。

如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏阳性菌。

2.染色过程中勿使染色液干涸。

用水冲洗后，应吸干残水或用吹风机吹干，以免染色液被稀释而影响染色效果。

3.革兰氏染色的菌种，选用培养18-24h菌龄的细菌为宜。

若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。

4.芽孢染色的菌种的菌龄，应使大部分芽孢仍保留在菌体内为宜。

巨大芽孢杆菌在37℃下培养12-14h效果最佳。

5.在孔雀绿加热过程中，要及时补充染液，切勿让涂片干涸。

实验三放线菌和真菌的形态观察

二、基本原理

放线菌是能形成分枝菌丝体的一类革兰氏阳性菌，是产生抗生素的最重要的微生物。

能否产生菌丝体及菌丝体分化产生的各种形态特征是放线菌分类鉴定的重要依据。

常见放线菌大多能形成菌丝体，紧贴培养基表面或深入培养基内生长的叫基内丝菌，基内丝菌向空气中生长出气生菌丝，气生菌丝进一步分化产生孢子丝及孢子。

有的放线菌只产生基丝而无气丝。

基丝较细透明，气丝较粗颜色较深，孢子丝有直、波曲、各种螺旋或轮生，孢子有球形，椭圆形，杆状或柱状，一般着生在孢子丝的顶端。

孢子丝和孢子的形态和排列方式是分类的重要依据。

扦片法可观察到不同生长时期放线菌自然生长状态下的形态特征。

是一种常用和有效的方法。

其主要原理是：

将放线菌接种在琼脂平板上，扦上灭菌盖玻片培养，使放线菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻片上。

观察时，轻轻取出盖玻片，置载玻片上直接镜检，就可观察到放线菌在自然状态下着生的各种形态特征，也可用吕氏碱性美蓝染色后观察。

真菌主要包括酵母菌和霉菌。

真菌大小通常比细菌大几倍甚至几十倍。

酵母菌是不运动的单细胞真核生物，大多数酵母菌以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖，有性繁殖产生子囊孢子。

而霉菌可产生复杂分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝长到一定阶段分化产生繁殖菌丝（分生孢子梗），由繁殖菌丝产生分生孢子。

霉菌的菌丝体尤其是繁殖菌丝及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。

美蓝是一种无毒性的染料，它可用来观察酵母菌的形态和出芽方式，也可对酵母菌的死活细胞进行鉴别，它的氧化型呈蓝色，还原形呈无色，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。

因此，具有还原能力的酵母菌细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色。

观察霉菌的形态主要有直接制片观察法和载片培养法。

直接观察法是将培养物置于乳酸石炭酸棉蓝染液中，制成霉菌玻片镜检。

用此方法制片能使细胞不变形，具有防腐作用，不易干燥，保存时间较长，防止孢子飞散；

染成蓝色增强反差，便于观察。

载片培养法见微生物实验教程。

1.菌种：

细黄链霉（Streptomycesmicroflavus）5406，红酵母（RhodotorulasP）或酿酒酵母（Sacchromycescerevisiae）,产黄青梅（Penicilliumchrysogenum）,黑曲霉（Aspergillusniger）,黑机霉（Rhizopusnigricans）,总状毛霉（Mucorracemosds）。

2.培养基：

高氏1号琼脂培养基、麦芽汁琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基或查氏培养基。

3.试剂：

0.1%美蓝染色液、乳酸石炭酸棉蓝染色液、50