基因工程江郁Word下载.docx

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*直接的遗传性疾病治疗和生物体改造：

转基因动、植物、

*促进对生命现象本质机理的研究：

糖尿病与糖尿病易感基因、癌基因与抗癌基因

5什么是“安全”的宿主-载体体系？

第一章基因操作的基本技术

第一节核酸制备

1、掌握提取细胞总RNA的原则。

如何实施？

为什么？

原则：

抑制RNase实施：

1）对于金属、玻璃器皿等，高温长时处理：

180C&

2hrs。

2）对于不耐热的塑料盒试剂，1%的二乙基焦碳酸乙酯（DEPC）。

3）对于活细胞中的RNase，使用对RNase有强烈抑制作用的细胞裂解剂。

eg：

盐酸胍、异硫氰酸胍（裂解细胞、抑制RNase、使核酸蛋白复合物解聚）；

氧钒基核苷复合物-RNA类似物；

RNasin-胎盘中制得。

4）防护与隔离：

戴手套、口罩。

5）控制温度：

考虑季节因素和注意低温条件。

2、掌握如何进行RNA制品的质量控制？

1）RNA的浓度和纯度测定

浓度：

A260nm时，1OD=40g/mlRNA。

纯度：

要求A260nm/A280nm=2.0（1.7-2.0或>

2.0）；

A260nm/A230nm>

2.0（防止多糖和酚类）。

2）RNA的完整性：

变性琼脂糖凝胶电泳检查28S：

18S2：

1

3）总RNA制品的保存

溶液法（TE或0.5%SDS__方便但不稳定）；

悬液法（溶液加3V乙醇__可靠但不方便）

2、掌握染色体DNA制备的原则。

各有哪些主要试剂？

其作用各是什么？

主要原则：

祛除蛋白及细胞碎片、祛除RNA、保持DNA分子完整

主要试剂及作用：

SDS（破坏膜结构，使蛋白质变性，核糖蛋白复合物解聚）；

EDTA（螯合金属离子抑制酶活）；

ProteinaseK（广泛降解蛋白）

3、掌握如何进行DNA样品的鉴定。

A260nm1OD=50g/mlDNA

要求A260nm/A280nm>

1.7&

2.0

4、掌握DNA片段制备的方法。

1）低熔点琼脂糖（lowmeltpoint）；

2）透析袋法（需浓缩）；

3）苯酚抽提法（不能彻底破坏琼脂糖结构、收率低）；

4）试剂盒；

不常用：

反复冻融法；

电洗脱法；

硝酸纤维素膜离心法

第二节质粒及质粒载体

5、掌握什么是质粒？

质粒有几类？

存在于细胞质中的一类独立于染色体的遗传成分，由环状双链的DNA组成的复制子。

分类：

F质粒-致育因子；

R因子-抗药性因子；

Col质粒-产生大肠杆菌素因子

或者：

接合型（F、Col、R可自我转移）&

非接合型（Col、R）

接合型质粒：

处理具备自主复制的遗传信息外还有一套控制细菌配对质粒接合转移的基因。

6、什么是质粒的转移？

什么是质粒的迁移？

迁移的原理是什么？

转移：

F质粒等通过F+细菌产生接合管将自身的一个拷贝传递给F-，使得F-变成F+的过程。

迁移：

由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移。

迁移原理：

非接合型质粒上有mob基因编码核酸酶，在bom（nic）位点特异性地切割，使质粒线性化通过其他接合型质粒转移过程中的接合管（转移器、性须）到达另一个细胞。

8、掌握质粒拷贝数的定义。

质粒的复制类型。

拷贝数的定义：

生长在标准培养条件下，每个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目。

每个细菌细胞染色体平均具有的质粒DNA分子的数目。

严密型（stringent）1-3copy（低拷贝数）；

松弛型（relaxed）10-60copy（高拷贝数）。

9、什么是质粒的不相容性？

在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒不能在同一个宿主细胞中稳定存在，因为其有相同或者相近的复制子，会互相竞争。

最后仅保留一种。

10、掌握用作克隆载体的基本条件是什么？

1）多个单一的酶切位点（MultiplyCloningSites）：

之所以要单一避免酶切是将载体切碎保持载体晚完整性；

多位点可以提供酶的多种选择。

2）具有复制起点（originori）：

可导入宿主，这是质粒自我增值不可缺少的基本条件。

3）具有选择标记（AprCmrSmr）：

便于筛选重组子。

4）低分子量和高拷贝数：

分子量越大越容易在操作中别剪切，并且低分子量可以允许载体有更大的容量。

注：

质粒载体类型：

（1）高拷贝质粒载体（ColE1pMB1）

（2）低拷贝质粒载体（pLG338pHS415）（3）插入失活型载体（pBR322）

11、掌握LacZ的筛选原理是什么？

（1）α互补：

一些大肠杆菌经过些事的LacZ基因，缺少LacZ’片段，该片段编码β-半乳糖苷酶的α肽片段，只能合成β-半乳糖苷酶的β片段，这些突变体遇到一个携带有正常LacZ’基因，如pUC18，就能合成β-半乳糖苷酶。

lacZ编码半乳糖苷酶的N端，它可以和宿主菌株产生的半乳糖苷酶C端互补，形成有活性的β-半乳糖苷酶。

（2）插入失活：

外源基因插入LacZ’基因后，就不能产生β-半乳糖苷酶，不能讲乳糖分解。

使用X-gal作为乳糖类食物额，当作β-半乳糖苷酶的底物降解后产生深蓝色产物。

当X-gal、酶诱导物IPTG、Amp一起加入培养基中，那么不含质粒的菌（无Ampr）不能生长，含有重组子的不能分解X-gal为白色，不含重组子的标记为蓝色。

12、掌握以碱裂解法提取质粒主要用什么试剂？

各有什么作用？

几大步骤中各会发生怎样的现象？

对数后期细菌煮沸法、SDS裂解法、碱裂解法

1）溶液I：

葡萄糖、Tris、EDTA

作用：

葡萄糖：

维持渗透压，使细菌不被破坏，保持结构完整性；

Tris：

缓冲液，维持一定离子强度和pH。

EDTA：

螯合金属离子，抑制RNase。

现象：

菌体被悬浮起来，呈黄色，溶液流动性较好，形成悬浊液。

2）溶液II：

NaOH、SDS

NaOH：

使pH上升懂啊10-12，核酸变性。

SDS：

去污剂，使细菌裂解，蛋白变性，核酸变性。

溶液变得非常粘稠。

3）溶液III：

KACpH4.8

调节pH至7，中和溶液II碱性，染色体DNA不能复性而沉淀，而质粒是小分子可以复性重新溶解，以此来分离染色体和质粒，剩下的沉淀是细胞碎片、染色体DNA和蛋白SDS复合物。

溶液形成很多沉淀，变得不在粘稠，经离心后固液想分离，质粒DNA在上清液中。

4）RNA酶消化残余RNA。

CsCl、NaCl、Sepharose离心

补充：

蓝白斑筛选时，白斑非重组体的原因和蓝斑是重组体的原因？

白斑非重组体的原因：

X-gal失效、载体成分丢失

蓝斑是重组体：

插入片段不影响ORF（readthrough）、不含终止密码子

第三节细菌的转化

14、掌握什么是感受态？

什么是转化？

Ca2+诱导感受态的原理是什么？

感受态：

在特殊处理或正常生长的某个时期，细胞的一种敏化的可以接受外源DNA的状态。

转化：

一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传性改变的生命过程。

Ca2+诱导感受态原理：

革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等）

Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，有利于外源DNA的导入。

//对于革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组DNA分子。

第四节凝胶电泳

15、什么是电泳？

如何制备RNA变性凝胶？

原理：

置于电场中的分子以一定的速度移向适当电极。

制备时分局目的RNA分子大小选择合适浓度的、无反应活性的、稳定凝胶介质。

加入变性剂如甲酰胺凝胶、尿素凝胶、羟甲基汞凝胶防止RNA分子形成二级结构影响迁移率。

原因：

保证RNA迁移率与其相对分子含量呈线性相关，因此RNA分析是在变性条件下进行的。

16、掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的特点。

优点：

分辨力高（可以分辨1bp的差异）、容量大（>

10g）、回收片段纯度高。

缺点：

制备时间长。

17、掌握PFGE的原理和应用。

脉冲电场凝胶电泳（PulsedFieldGelElectrophoresisPFGE）—制备染色体长片段

加在琼脂糖凝胶上的电场方向、电流大小及作用时间交替变化，两电场方向垂直，DNA分子的迁移方向随所用的电场方向周期性变化而不断改变。

在交变电场下，分子可以充分伸展，且分子量越大，走德越慢。

应用：

制备染色体长片段

特点：

施加交变电场&

分离分子大小范围5kb~2Mb

18、影响琼脂糖凝胶DNA电泳的因素有哪些？

1）DNA分子大小；

2）琼脂糖浓度：

浓度月供啊，分离范围越小，且胶易脆，韧性下降；

3）DNA构象：

相同分子量超螺旋最快、其次为线性、最慢为开环结构；

4）所加电压，打压越高，迁移率快，分辨率降低。

第五节核酸探针

19、什么是核酸探针？

用核酸作探针的原因。

核酸探针的特性。

能识别特异碱基序列的有标记的一段单链DNA（或RNA）分子，即一段与被测定的核苷酸序列（靶序列）互补的带标记的单股核苷酸。

用核酸做探针的原因：

*信息量丰富*不同生物含可区别的DNA序列*稳定性。

特性：

敏感性高（可以以检测极低浓度靶序列）、特异性强、简便。

20、掌握核酸探针的标记方法及其原理。

1）切口平移（nicktranslation）DNApolI

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ可利用双螺旋DNA链上由一个磷酸二酯键断裂产生的缺刻，将一条单链降解并从缺刻的3'

-OH端合成一条新链替代降解的同源链。

应用核酸探针标记。

2）末端转移（T4DNA聚合酶）

使用T4DNA聚合酶，首先在不添加dNTP时，外切酶活性站主导，从3’端水解形成5’突出末端，然后加入标记的dNTP，此时合成活性占主导地位，合成3’末端标记的新链。

3）随机引物标记

将双链模本变性后结合随机引物，以标记的dNTP为原料接触DNA片段探针。

所谓随机引物是含有各种可能排列的寡核苷酸片段的混合物，非常短常6bp，这样引物在链上结合呈随机性。

4）体外转录

将靶序列插入pSP64载体中，然后用PvulI等远距离限制性酶将其线性化，加入SP6RNApol和标记的NTP，即可转录出带标记的RNA探针。

21、掌握核酸探针的分子杂交类型、原理及其比较和适用性。

1）Southernblothybridization（印迹杂交）DNA毛细现象

根据毛细管作用原理，使凝胶电泳分离并将作为变性出来的处理的DNA片段转移到硝酸素滤膜（尼龙膜）上，然后同标记的单链DNA或RNA探针杂交，适用于检测被转移到膜上的DNA。

2）NorthernBlothybridization（RNA）

根据毛细管作用原理，将的RNA片段转移到硝酸素滤膜（尼龙膜）上，然后同标记的单链DNA或RNA探针杂交，适用于检测被转移到膜上的DNA。

3）斑点/狭缝杂交（Dot/Slot）

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