微生物作业指导书Word文档下载推荐.docx

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第七章生活饮用水的微生物检测---------第12页

第八章实验室生物安全防护规则----------第13页

第九章常见微生物检测仪器操作-----------第14页

第十章车间卫生的检测------------------------第16页

第一章样品的处理

1.本方法参考GB4789.1-2010

2.样品的采集

2.1采样原则

2.1.1根据检验目的、食品特点、批量、检验方法、微生物的危害程度等确定采样方案。

2.1.2应采用随机原则进行采样，确保所采集的样品具有代表性。

2.1.3采样过程遵循无菌操作程序，放置一切可能的外来污染。

2.1.4样品在保存和运输的过程中，应采取必要的措施防止样品中原有微生物的数量变化，保持样品的原有状态。

2.2采样方案

2.2.1类型

采样方案分为二级和三级采样方案。

二级采样方案设有n、c和m值，三级采样方案设有n、c、m和M值。

n：

同一批次产品应采集的样品件数；

c：

最大可允许超出m值的样品数；

m：

微生物指标可接受水平的限量值；

M：

微生物指标的最高安全限量值。

例如：

n=5，c=2，m=100CFU/g，M=1000CFU/g。

含义是从一批产品中采集5个样品，若5个样品的检验结果均小于或等于m值（≤100CFU/g），则这种情况是允许的；

若≤2个样品的结果（X）位于m值和M值之间（100CFU/g＜X≤1000CFU/g），则这种情况也是允许的；

若有3个及以上样品的检验结果位于m值和M值之间，则这种情况是不允许的；

若有任一种样品的检验结果大于M值（＞1000CFU/g），则这种情况也是不允许的。

2.2.2各类食品的采样方案

按相应产品标准中的规定执行。

2.2.3食源性疾病及食品安全事件中食品样品的采集

由工业化批量生产加工的食品污染导致的食源性疾病或食品安全事件，食品样品的采集和判定原则按2.2.1和2.2.2执行。

同时，确保采集现场剩余食品样品。

2.3各类食品的采样方法

采样应遵循无菌操作程序，采样工具和容器应无菌、干燥、防漏，形状及大小适宜。

2.3.1即食类预包装食品

取相同的最小零售原包装，检验前腰保持包装的完整，避免污染。

2.3.2非即食类预包装食品

原包装小于500g的固态食品或小于500ml的液态食品，取相同批次的最小零售原包装；

大于500ml的液态食品，应在采样前摇动或用无菌棒搅拌液体，使其达到均质后分别从相同批次的n个容器中采集5倍或以上检验单位的样品；

大于500g的固态食品，应用无菌采样器从同一包装的几个不同部位分别采取适量样品，放入同一个无菌采样容器内，采样总量应满足微生物指标检验的要求。

2.3.3散装食品或现场制作食品

根据不同食品的种类和状态及相应检验方法中规定的检验单位，用无菌采样器现场采集5倍或以上检验单位的样品，放入无菌采样容器内，采样总量应满足微生物指标检验的要求。

2.3.4食源性疾病及食品安全事件的食品样品

采样量应满足食源性疾病诊断和食品安全事件病因判定的检验要求。

2.4采集样品的标记

应对采集的样品进行及时、准确的记录和标记，采样人应清晰填写采样单（包括采样人、采样地点、时间、样品名称、来源、批号、数量、保存条件等信息）。

2.5采集样品的贮存和运输

采样后，应将样品在接近原有贮存温度条件下尽快送往实验室检验。

运输时应保持样品完整。

如不能及时运送，应在接近原有贮存温度条件下贮存。

第二章消毒和灭菌

消毒是指应用消毒剂等方法杀灭物体表面和内部的病原菌营养体的方法，而灭菌是指用物理和化学方法杀死物体表面和内部的所有微生物，使之呈无菌状态。

1物理方法

利用温度进行灭菌、消毒或防腐，是最常用而又方便有效的方法。

高温可使微生物细胞内的蛋白质和酶类发生变性而失活，从而起灭菌作用，低温通常起抑菌作用。

1.1干热灭菌法

1.1.1灼烧灭菌法：

利用火焰直接把微生物烧死。

此法彻底可靠，灭菌迅速，但易焚毁物品，所以使用范围有限，只适合于接种针、环、试管口及不能用的污染物品或实验动物的尸体等的灭菌。

1.1.2干热空气灭菌法：

这是实验室中常用的一种方法，即把待灭菌的物品均匀地放入烘箱中，升温至160°

C，恒温2小时以上即可。

此法适用于玻璃皿、金属用具等的灭菌。

1.2加压蒸汽灭菌法

在同样的温度下，湿热灭菌的效果比干热灭菌好，这是因为一方面细胞内蛋白质含水量高，容易变性。

另一方面高温水蒸汽对蛋白质有高度的穿透力，从而加速蛋白质变性而迅速死亡。

它适用于各种耐热、体积大的培养基的灭菌，也适用于玻璃器皿、工作服等物品的灭菌。

加压蒸汽灭菌是把待灭菌的物品放在一个可密闭的加压蒸汽灭菌锅中进行的，以大量蒸汽使其中压力升高。

由于蒸汽压的上升，水的沸点也随之提高。

在蒸汽压达到1.055公斤/厘米2时，加压蒸汽灭菌锅内的温度可达到121°

C。

在这种情况下，微生物（包括芽孢）在15~20分钟便会被杀死，而达到灭菌目的。

在加压蒸汽灭菌中，在恒压之前，一定要排尽灭菌锅中的冷空气，否则表上的蒸汽压与蒸汽温度之间不具对应关系，这样会大大降低灭菌效果。

2.化学方法

由于消毒防腐剂没有选择性，因此对一切活细胞都有毒性，不仅能杀死或抑制病原微生物，而且对人体组织细胞也有损伤作用，所以只能用于体表、器械和周围环境的消毒。

按照其作用的水平可分为灭菌剂、高效消毒剂、中效消毒剂、低效消毒剂。

灭菌剂：

可杀灭一切微生物使其达到灭菌要求的制剂。

包括甲醛、戊二醛、环氧乙烷、过氧乙酸、过氧化氢、二氧化氯等。

高效消毒剂：

指可杀灭一切细菌繁殖体（包括分枝杆菌）、病毒、真菌及其孢子等，对细菌芽胞也有一定杀灭作用，达到高水平消毒要求的制剂。

包括含氯消毒剂、臭氧等。

中效消毒剂：

指仅可杀灭分枝杆菌、真菌、病毒及细菌繁殖体等微生物，达到消毒要求的制剂。

包括含碘消毒剂、醇类消毒剂、酚类消毒剂等。

低效消毒剂：

指仅可杀灭细菌繁殖体和亲脂病毒，达到消毒剂要求的制剂。

包括苯扎溴铵等季铵盐类消毒剂。

化学消毒剂的应用形式：

2.1擦拭法：

选用易溶于水、穿透性强的消毒剂，擦拭物体表面，在一定的浓度和时间内达到消毒灭菌的效果。

2.2浸泡法：

选用杀菌谱广、腐蚀性弱、水溶性的消毒剂，将物品浸泡在消毒剂内，在一定的浓度和时间内达到消毒灭菌的效果。

2.3熏蒸法：

加热或加入氧化剂，使消毒剂呈气体状态，在一定的浓度和时间内达到消毒灭菌的效果。

适用于室内物品和空气消毒。

2.4喷雾法：

借助喷雾器，使消毒剂产生微粒气雾弥散在空间，如用2%过氧乙酸和季铵盐类喷雾，进行空气和物体表面的消毒。

第三章菌落总数测定

1.检验方法参见GB4789.2-2010《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验菌落总数测定》

2.菌落总数介绍：

菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。

当样品被稀释到一定程度，与培养基混合，在一定培养条件下，每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。

菌落总数就是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的细菌菌落总数。

按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37℃培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。

因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。

食品检样中的细菌细胞是以单个、双个、链状、葡萄状或成堆的形式存在，因而在营养琼脂平板上出现的菌落可以来源于细胞块，也可以来源于单个细胞，因此平板上所得需氧和兼性厌氧菌菌落的数字不能报告为活菌数，而以单位质量、容积或表面积内的菌落数（colonyformingunits，CFU）报告之。

3检样稀释及培养

3.1样品的稀释

3.1.1固体和半固体样品：

称取25g样品置盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或放入盛有225ml稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，支撑1:

10的样品匀液。

3.1.2液体样品：

以无菌吸管吸取25ml样品置盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，支撑1:

3.1.3用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1:

10样品匀液1ml，沿管壁缓慢注于盛有9ml稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:

100的样品匀液。

3.1.4按3.1.3操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。

每递增稀释一次，换用一次1ml无菌吸管或吸头。

3.1.5根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1ml样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。

同时，分别吸取1ml空白稀释液加入两个无菌平皿内做空白对照。

3.1.6及时将15ml～20ml冷却至46℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46℃±

1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。

3.2培养

3.2.1待琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±

1℃培养48h±

2h，水产品30℃±

1℃培养72h±

3h。

3.2.2如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4ml），凝固后翻转平板，按3.2.1条件进行培养。

4菌落计数

可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。

菌落计数以菌落形成单位（colony-formingunits,CFU）表示。

4.1选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。

低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。

每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

4.2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；

若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，则以计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。

4.3当平板上出现菌落间无明显界限的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。

5结果与报告

5.1菌落总数的计算方法

5.1.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（ml）样品中菌落总数结果。

5.1.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式

（1）计算：

N=∑C/（

）d………………………

（1）