第三节免疫检测技术的基本原理PPT文档格式.ppt

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定性试验玻片直接凝集法：

定性试验试管直接凝集法：

半定量试验试管直接凝集法：

半定量试验试管法半定量试验试管法半定量试验试管法半定量试验试管法半定量试验+玻片直接凝集试验玻片直接凝集试验1/21/41/81/161/321/641/1281/2561/5122.2.间接凝集法间接凝集法先先将将可可溶溶性性抗抗原原或或抗抗体体吸吸附附在在颗颗粒粒载载体体上上（如如RBC,RBC,乳乳胶胶颗颗粒粒），再再与与相相应应抗抗体体或或抗抗原反应，出现凝集为阳性结果。

原反应，出现凝集为阳性结果。

临临床床常常用用的的有有间间接接血血凝凝试试验验、乳乳胶胶凝凝集集试试验等。

验等。

+待检样品待检样品抗原吸附血球抗原吸附血球或乳胶颗粒或乳胶颗粒反应凝集物反应凝集物3.3.间接凝集抑制试验间接凝集抑制试验先先将将待待检检抗抗原原与与已已知知的的抗抗体体反反应应，再再加加入入用用已已知知抗原吸附的载体颗粒，不出现凝集为阳性结果。

抗原吸附的载体颗粒，不出现凝集为阳性结果。

例：

乳胶凝集抑制试验检测例：

乳胶凝集抑制试验检测HCG（HCG（妊娠诊断妊娠诊断）步步骤骤11：

将将已已知知抗抗体体与待检标本混匀与待检标本混匀步步骤骤22：

加加入入抗抗原原吸吸附的乳胶颗粒混匀附的乳胶颗粒混匀抗抗原原吸吸附附乳胶颗粒乳胶颗粒结果判断：

结果判断：

不不凝凝集集为为阳性结果阳性结果已知抗体已知抗体待检标本待检标本凝集反应凝集反应2.沉淀反应沉淀反应概念：

可溶性抗原与相应抗体结合后出概念：

可溶性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物称沉淀反应。

现沉淀物称沉淀反应。

类型：

单向免疫扩散单向免疫扩散免疫比浊法免疫比浊法双向免疫扩散双向免疫扩散对流免疫电泳对流免疫电泳单向琼脂扩散试验单向琼脂扩散试验双向琼脂扩散试验双向琼脂扩散试验对流免疫电泳对流免疫电泳测吸光度测吸光度计算抗原计算抗原或抗体的或抗体的含量含量抗体抗体抗原抗原免疫复合物的免疫复合物的浓度与透射光浓度与透射光的衰减呈正相的衰减呈正相关关免疫比浊法原理免疫比浊法原理3.中和反应中和反应如抗如抗“O”试验试验4.免疫标记技术免疫标记技术概念：

用荧光素、酶、同位素等概念：

用荧光素、酶、同位素等标记抗体或抗原用以测定相应抗原或标记抗体或抗原用以测定相应抗原或抗体的技术称为免疫标记技术。

常用抗体的技术称为免疫标记技术。

常用方法有免疫荧光技术、酶免疫技术、方法有免疫荧光技术、酶免疫技术、放射免疫检测技术等。

放射免疫检测技术等。

特点：

敏感、特异、快速，能定特点：

敏感、特异、快速，能定性、定量、定位。

性、定量、定位。

免疫标记技术酶免疫标记技术荧光免疫分析技术放射免疫分析技术免疫金标记技术酶联免疫吸附试验1971年瑞典学者年瑞典学者Engvail和和Perlmann,荷兰学者荷兰学者VanWeerman和和Schuurs分分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法附测定法（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）酶及其底物酶及其底物酶结合物是酶与抗体或抗原酶结合物是酶与抗体或抗原,半抗原半抗原在交联剂作用下联结的产物。

是在交联剂作用下联结的产物。

是ELISAELISA成败成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物放大作用，但不同的酶选用不同的底物，将得到不同的颜色反应将得到不同的颜色反应.酶酶底底物物显色显色反应反应测定波长测定波长辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶邻苯二胺邻苯二胺四甲替联苯胺四甲替联苯胺氨基水杨酸氨基水杨酸邻联苯甲胺邻联苯甲胺2,2-2,2-连胺基连胺基-2（3-2（3-乙基乙基-并噻并噻唑啉磺酸唑啉磺酸-6）-6）铵盐铵盐橘红色橘红色黄色黄色棕色棕色兰色兰色蓝绿色蓝绿色492492460460449449425425642642碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶4-4-硝基酚磷酸盐硝基酚磷酸盐（PNP）（PNP）萘酚萘酚-AS-AS-MxMx磷酸盐磷酸盐+重氮盐重氮盐黄色黄色红色红色400400500500葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪甲硫酚嗪+噻唑兰噻唑兰黄色黄色深蓝色深蓝色405405420420-半乳糖半乳糖苷酶苷酶甲基伞酮基半乳糖苷甲基伞酮基半乳糖苷（4MuG）（4MuG）硝基酚半乳糖苷硝基酚半乳糖苷（ONPG）（ONPG）荧光荧光黄色黄色360,450360,4504204202、标记方法戊二醛交联法过碘酸盐氧化法戊二醛交联法戊二醛交联法（一步法）一步法）抗体-NH2+COH-（CH2）3-COH+NH2-酶抗体-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-酶抗体-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-抗体酶-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-酶戊二醛交联法（二步法）戊二醛交联法（二步法）COH-（CH2）3-COH+NH2-酶抗体-NH2+CHO-（CH2）3-CH=NH2-酶抗体-NH2=CH-（CH2）3-CH=NH2-酶过碘酸盐氧化法过碘酸盐氧化法OOOOOONaIO4OOOHOOOHOH+NH2抗体OOONN抗体抗体H2ON抗体NaBH4Schiff碱酶-五炭糖环标记免疫物的分离与鉴定标记免疫物的分离与鉴定1、分离目的：

去除游离酶方法：

盐析、柱层析2、鉴定抗体活性酶活性标记物纯度ELISAELISA的种类和变化的种类和变化

（一）双抗体夹心法

（一）双抗体夹心法

（二）间接法

（二）间接法（三）（三）竞争法竞争法（四）（四）双位点一步法双位点一步法（五）捕获法测（五）捕获法测IgMIgM抗体抗体（六）应用亲和素和生物素的（六）应用亲和素和生物素的ELISAELISA

（一）双抗体夹心法

（一）双抗体夹心法此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原获得待分析物的未标定抗体获得待分析物的未标定抗体将特异性抗体与固相将特异性抗体与固相载体连接形成固相抗体载体连接形成固相抗体洗涤除去未结合的洗涤除去未结合的抗体及杂质抗体及杂质加入封闭蛋白溶液以封闭载体加入封闭蛋白溶液以封闭载体表面残留的蛋白结合位点表面残留的蛋白结合位点洗涤并除去未结合的封闭蛋白洗涤并除去未结合的封闭蛋白加受检标本（抗原）形成加受检标本（抗原）形成固相抗体抗原复合物固相抗体抗原复合物洗涤除去其他洗涤除去其他未结合的物质未结合的物质加酶标抗体生成加酶标抗体生成抗体抗体待测抗原待测抗原酶标记抗体酶标记抗体的复合物的复合物彻底洗涤彻底洗涤未结合的未结合的酶标抗体酶标抗体加底物进行加底物进行酶催化反应酶催化反应根据颜色反应的根据颜色反应的程度进行该抗原程度进行该抗原的定性或定量测定的定性或定量测定间接法是检间接法是检测抗体最常用的方测抗体最常用的方法，其原理为利用法，其原理为利用酶标记的抗抗体以酶标记的抗抗体以检测已与固相结合检测已与固相结合的受检的受检抗体抗体，故称，故称为间接法。

为间接法。

（二）间接法

（二）间接法酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验（ELISA-间接法间接法）包被固相载体包被固相载体:

用已知抗原包被用已知抗原包被固相载体固相载体加待检标本加待检标本:

使相应抗体与固相抗原结合使相应抗体与固相抗原结合洗涤，除去无关的物质洗涤，除去无关的物质加酶标抗抗体加酶标抗抗体:

与固相载体上抗原抗体与固相载体上抗原抗体复合物结合；

洗涤，除去复合物结合；

洗涤，除去未结合的酶标抗抗体未结合的酶标抗抗体加底物加底物显色显色根据颜色反应的程度进行根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定该抗原的定性或定量测定（三）竞争法（三）竞争法此法可用于抗原和半抗原的定此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体量测定，也可用于测定抗体。

用已知特异性用已知特异性抗体包被抗体包被固相载体固相载体测定管加待测抗原和测定管加待测抗原和一定量的酶标抗原使二者与一定量的酶标抗原使二者与固相抗体竞争结合固相抗体竞争结合对照管只加一定量酶标抗原对照管只加一定量酶标抗原与固相抗体直接结合与固相抗体直接结合分别洗涤分别洗涤除去未结合除去未结合的成分的成分加底物显色加底物显色分别测定两管的吸光度值，分别测定两管的吸光度值，根据对照管与测定管吸光度值之比，根据对照管与测定管吸光度值之比，计算标本中待测抗原含量计算标本中待测抗原含量对照管由于只加酶标抗原，与固对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色深；

相抗体充分结合，故分解底物显色深；

测定管的显色程度则随待测抗原和酶测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异。

如待测抗原量多，竞争性地抑制异。

如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。

因此，加入结合的酶标抗原量减少。

因此，加入底物后显色反应较弱。

底物后显色反应较弱。

饲料中盐酸克伦特罗的测定饲料中盐酸克伦特罗的测定饲料中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素，饲料中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素，简曲霉毒素简曲霉毒素）饲料中有害微生物的快速筛检饲料中有害微生物的快速筛检（如沙门氏（如沙门氏菌菌）甲胺磷残留分析甲胺磷残留分析甲基对硫磷残留分析甲基对硫磷残留分析呋喃丹残留分析呋喃丹残留分析ELISA在饲料安全检测中的应用在饲料安全检测中的应用ELISA用于农药残留的检测用于农药残留的检测河豚毒素河豚毒素植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素苯并芘苯并芘主要有除草剂与杀虫剂两大类主要有除草剂与杀虫剂两大类例如杀暝松（例如杀暝松（FNFN）、）、甲氟磷酸异已酶（甲氟磷酸异已酶（SOMANSOMAN）、）、草不绿（草不绿（AlachorAlachor）、）、西维因（西维因（CarbarylCarbaryl）、）、多菌灵及克菌丹（多菌灵及克菌丹（CaptanCaptan）等）等。

农药的检测农药的检测：

食源性病原菌检测试剂盒大肠杆菌检测沙门氏菌检测单增李斯特菌金黄色葡萄球菌转基因成份的检测：

如转基因玉米中转基因成份的检测：

如转基因玉米中中的中的cry9e蛋白蛋白转基因大豆中的转基因大豆中的CP4EPSPS蛋白质蛋白质肉制品的掺假检测：

肉制品的掺假检测：

以辣根过氧化物酶标记不同动物肌肉和血清球蛋以辣根过氧化物酶标记不同动物肌肉和血清球蛋A抗血清检查牛肉、马肉、猪肉、羊肉和驼肉检测抗血清检查牛肉、马肉、猪肉、羊肉和驼肉检测14种种畜禽熟肉制品，包括牛肉、羊肉、鹿肉和马肉等，在畜禽熟肉制品，包括牛肉、羊肉、鹿肉和马肉等，在掺假率为掺假率为1%时即可检出时即可检出食品其他检测食品其他检测：

荧光抗体技术的原理与方法荧光抗体技术的原理与方法用用荧荧光光素素标标记记抗抗原原或或抗抗体体，再再与与标标本本中中抗抗体体或或抗抗原原反反应应，然然后后在在荧荧光光显显微微镜镜下下观观察察，形形成成的的ICIC可可散散发发出出荧荧光