细胞生物学：第二章细胞生物学实验技术PPT格式课件下载.ppt

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NA为镜口率为镜口率sin/2；

n=介质折射率；

=镜口角（样品对物镜镜口的张角）。

表一、几种介质的折射率显微镜的几个光学特点：

显微镜的几个光学特点：

介质折射率越接近镜头玻璃的（1.7）越好；

sin/2的最大值小于1；

镜口率最大约1.6；

普通光线的波长为400700nm，光镜分辨力约为0.2m，人眼的分辨力为0.2mm，因此显微镜的最大有效倍数为1000X。

（二）荧光显微镜Fluorescencemicroscope特点：

光源为短波光；

有两个特殊的滤光片；

照明方式通常为落射式。

Fluorescenceimage,DNAinblueandMicrotubulesingreen用于观察能激发出荧光的结构。

用途：

免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。

（三）激光共聚焦扫描显微境Laserconfocalscanningmicroscope,LCSM用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描；

能显示细胞样品的立体结构；

分辨力是普通光学显微镜的3倍；

用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。

laserconfocalscanningmicroscope,LCSM激光共聚焦扫描显微镜光路图LCSMImageofaXenopusMelanophoremicrotubulecytoskeleton（green）andthenucleus（blue）（四）暗视野显微镜darkfieldmicroscope聚光镜中央有挡光片，视野背景是黑的，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，物体边缘是亮的。

可观察4200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍。

（五）相差显微镜把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。

在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。

1.环形光阑（annulardiaphragm）：

位于光源与聚光器之间。

2.相位板（annularphaseplate）：

物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4。

原理用途：

观察未经染色的玻片标本。

（六）偏光显微镜polarizingmicroscope用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等。

进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器（与起偏器方向垂直的偏振片）。

载物台可以旋转。

淀粉（七）微分干涉差显微镜Differentialinterferencecontrastmicroscope（DIC）1952年Nomarski发明，利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。

标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。

Figure3-11.Fourtypesoflightmicroscopy.（A）Theimageofafibroblastincultureobtainedbythesimpletransmissionoflightthroughthecell,atechniqueknownasbright-fieldmicroscopy.Theotherimageswereobtainedbytechniquesdiscussedinthetext:

（B）phase-contrastmicroscopy,（C）Nomarskidifferential-interference-contrastmicroscopy,and（D）dark-fieldmicroscopy.（八）倒置显微镜inversemicroscope物镜与照明系统颠倒；

用于观察培养的活细胞，通常具有相差或DIC物镜，有的还具有荧光装置。

（九）当代显微镜的发展趋势采用组合方式，集普通光镜、相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体；

自动化与电子化。

二、电子显微镜电子显微镜的基本构造电子显微镜的基本构造1.原理以电子束作光源，电磁场作透镜。

电子束波长与加速电压（通常50120KV）的平方根成反比；

由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成；

分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍；

用于观察超微结构（小于0.2m）。

（一）透射电子显微镜一）透射电子显微镜transmissionelectronmicroscope,TEM表二、不同光线的波长TEMLIGHTPATHWAY电镜与光镜的比较电镜与光镜的比较显微镜分辨本领光源透镜真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可见光（400-700）紫外光（约200nm）电子束（0.01-0.9）玻璃透镜玻璃透镜电磁透镜不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-51.33x10-3Pa利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差电镜与光镜光路图比较电镜与光镜光路图比较TRANSMISSIONELECTRONMICROSCOPE，TEM2.制样技术1）超薄切片）超薄切片超薄切片厚度仅50nm左右，用超薄切片机（ultramicrotome）制作。

通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。

2）负染技术用重金属盐（如磷钨酸）染色；

吸去染料干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。

NegativeStainedArchaebacteriaExamplesofnegtivelystainedandmetal-shadowedspecimens.Electronmicrographsofatobaccorattlevirusafternegtivestainingwithpotassiumphosphotungstate（a）orshadowcastingwithchromium（b）.3）冰冻蚀刻freeze-etching亦称冰冻断裂。

标本置于干冰或液氮中冰冻。

然后断开，升温后，冰升华，暴露断面结构。

向断面喷涂一层蒸汽铂和碳。

然后将组织溶掉，把铂和碳的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。

anonionroottipcellwithnoetching.断面的三种处理方法：

蚀刻（etching）、不蚀刻（noetching）、深度蚀刻（deepetching）培养细胞内面的深度蚀刻电镜照片，示Clathrin衣被

（二）扫描电子显微镜20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构；

分辨力为610nm，因人眼的分辨力（区别荧光屏上距离最近两个光点的能力）为0.2mm，扫描电镜的有效放大倍率为0.2mm/10nm=20000X。

Figure3-23.Scanningelectronmicroscopy.Scanningelectronmicrographofthestereociliaprojectingfromahaircellintheinnerearofabullfrog（A）.Forcomparison,thesamestructureisshownbydifferential-interference-contrastlightmicroscopy（B）andbythin-sectionelectronmicroscopy（C）.Scanningelectronmicroscope（SEM）工作原理：

是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。

为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。

SEMLIGHTPATHWAY人类红细胞人类红细胞酵母酵母人类精子人类精子（三）扫描隧道显微镜scanningtunnelingmicroscope，STM原理：

根据隧道效应设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV2V），针尖与样品之间形成隧道电流。

电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。

分辨率：

横向为0.10.2nm，纵向可达0.01nm。

三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。

扫描隧道显微镜原理引自http:

/www.iap.tuwien.ac.atSTMimageofaDNAmoleculeSchematicdrawingofAFM三、显微操作技术micromanipulationtechnique是在倒置显微镜下利用显微操作器进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。

包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。

细胞核移植技术已有几十年的历史，1952年，Briggs和King等将不同阶段的蛙胚细胞核注入去核的蛙卵，构建核移植胚。

Gordon（1962）证明原肠胚以后的细胞核移植能发育到成体。

1997年，Wilmut等克隆了绵羊Dolly。

显显微微操操作作仪仪转基因显微操作过程电镜三维重构技术电镜三维重构技术电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。

具有重要应用前景的一门新技术。

电镜三维重构技术与电镜三维重构技术与X-X-射线晶体衍射技术及核磁共振射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学分析技术相结合，是当前结构生物学（StructuralBiologyStructuralBiology）主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。

主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。

第二节生物化学与分子生物学技术一、细胞化学技术一、细胞化学技术组织化学和细胞化学染色方法用于对某些细胞成分进行定性和定位研究。

（一）固定

（一）固定1.物理固定：

血膜空气干燥、冷冻干燥。

2.化学固定：

如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂。

显示多糖常用乙醇固定，显示酶类多用甲醛丙酮缓冲液固定。

（二）显示方法1.金属沉淀法：

如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。

2.Sch