RNA提取及PCR相关技术_精品文档PPT格式课件下载.ppt

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或或立即立即分离白细胞后，于分离白细胞后，于Trizol液中液中-80保存。

试剂耗材准备工作试剂耗材准备工作目的：

去除目的：

去除RNase，防止，防止RNA降解降解各种离心管、各种离心管、Tip头、冷冻保存管等塑料器皿：

头、冷冻保存管等塑料器皿：

浸泡在浸泡在0.1%的的DEPC水中，过夜处理，次日烘干，水中，过夜处理，次日烘干，高压灭菌后再次烘干。

高压灭菌后再次烘干。

锡箔纸、玻璃匀浆管、研钵、手术剪刀、镊子、移液管锡箔纸、玻璃匀浆管、研钵、手术剪刀、镊子、移液管等玻璃、金属及陶瓷制品：

等玻璃、金属及陶瓷制品：

用锡箔纸严密包裹后，用锡箔纸严密包裹后，150高温烘烤高温烘烤4小时。

小时。

前期准备工作前期准备工作RNase-free水：

水：

0.1DEPC处理去离子水过夜，次日高压灭菌除去处理去离子水过夜，次日高压灭菌除去残留残留DEPC，分装，分装1.5mlEppendorf管，管，4保存。

75乙醇：

乙醇：

用用RNase-free水配制，分装为水配制，分装为50ml，4保存。

氯仿、异丙醇、无水乙醇：

新包装开封后，分装新包装开封后，分装50ml，4保存。

注意：

DEPC有吸入毒性，需穿工作服，戴手套、口罩操作。

有吸入毒性，需穿工作服，戴手套、口罩操作。

样本准备样本准备组织组织大鼠组织大鼠组织大鼠组织大鼠组织样品量样品量样品量样品量总总总总RNARNA量（量（量（量（gg）脑脑脑脑10mg10mg88肺肺肺肺10mg10mg1010肾脏肾脏肾脏肾脏10mg10mg1010心脏心脏心脏心脏10mg10mg2020脾脏脾脏脾脏脾脏10mg10mg3535肝脏肝脏肝脏肝脏10mg10mg404050100mg组织对应组织对应1mlTrizol样本准备样本准备细胞细胞悬浮细胞：

生长对数期诱导后，悬浮细胞：

生长对数期诱导后，5000g，5min离心去离心去除培养基，收集约除培养基，收集约5-10106个细胞。

个细胞。

每每5-10106个细胞对应个细胞对应1mlTrizol贴壁细胞：

生长对数期诱导后，收集约贴壁细胞：

生长对数期诱导后，收集约5-10106个细个细胞，倒掉培养基，加入预热胞，倒掉培养基，加入预热PBS洗一次，去洗一次，去除除PBS。

每每10cm2培养面积对应培养面积对应1mlTrizolRNA的提取的提取注意佩戴口罩、勤更换手套注意佩戴口罩、勤更换手套组织组织

（1）液氮预冷研钵；

）液氮预冷研钵；

（2）液氮研磨，至样品呈粉末状（需）液氮研磨，至样品呈粉末状（需8-10min）；

）；

（3）向研钵内加入）向研钵内加入1mlTrizol继续研磨，至呈不黏稠液态；

继续研磨，至呈不黏稠液态；

（4）将混合液转移至玻璃匀浆器中，冰上匀浆）将混合液转移至玻璃匀浆器中，冰上匀浆3min；

（5）将匀浆液转移至）将匀浆液转移至1.5mlEppendorf管，室温孵育管，室温孵育5min；

裂解裂解RNA的提取的提取细胞细胞悬浮细胞：

离心收集后，倒除培养液，加入悬浮细胞：

离心收集后，倒除培养液，加入1mlTrizol反反复吹打细胞，至溶液不黏稠。

复吹打细胞，至溶液不黏稠。

贴壁细胞：

倒除培养液，贴壁细胞：

倒除培养液，PBS洗涤一次后，直接在培养洗涤一次后，直接在培养瓶或培养板中加入瓶或培养板中加入1mlTrizol反复吹打细胞，反复吹打细胞，直至溶液不黏稠。

直至溶液不黏稠。

室温孵育混合液室温孵育混合液10min后，转移至后，转移至1.5mlEppendorf管管裂解裂解Trizol匀浆孵育后匀浆孵育后80保存保存加入加入0.2ml氯仿氯仿，剧烈摇动剧烈摇动15s;

3minatRT,12,000gx15min,4分层分层取水相，取水相，0.5mL异丙醇异丙醇，颠倒混匀，颠倒混匀，10minatRT4，12,000gx10min（片状沉淀物为（片状沉淀物为RNA）沉淀沉淀去上清，去上清，1ml75乙醇乙醇洗涤洗涤，7,500gx5minat4，重复一次，重复一次洗涤洗涤空气干燥，加空气干燥，加50ulRNase-free水，水，55孵育溶解孵育溶解干燥干燥溶解溶解RNA提取优化步骤提取优化步骤

（1）对得率较低的样本，可在异丙醇沉淀一步，选用）对得率较低的样本，可在异丙醇沉淀一步，选用-20度过夜孵育，以增加得率。

度过夜孵育，以增加得率。

（2）对多糖含量较高的样本，可在异丙醇沉淀一步，加入）对多糖含量较高的样本，可在异丙醇沉淀一步，加入高盐溶液（高盐溶液（0.8M柠檬酸钠和柠檬酸钠和1.2MNaCl），），-20度过度过夜共孵育，以去除多糖物质的污染。

夜共孵育，以去除多糖物质的污染。

所有试剂均需无酶水配制。

RNA鉴定及初定量鉴定及初定量

（1）测量）测量OD值值得率及纯度检测得率及纯度检测得率得率总总RNA浓度（浓度（ug/ml）OD260稀释倍数稀释倍数40ug/ml（通常（通常OD260数值介于数值介于0.15-1.0之间才可靠）之间才可靠）纯度纯度OD260/280检测检测RNA纯度纯度值在值在1.8-2.1之间，之间，RNA纯度较好；

纯度较好；

值小于值小于1.8，表明蛋白杂质较多；

，表明蛋白杂质较多；

值大于值大于2.2，表明，表明RNA已降解；

已降解；

RNA鉴定及初定量鉴定及初定量

（2）琼脂糖凝胶电泳）琼脂糖凝胶电泳RNA完整性鉴定完整性鉴定13ulRNA溶液上样，溶液上样，1胶，胶，100V电泳电泳10min。

完整完整RNA呈现明显两条带呈现明显两条带28S，18S，且且28S带约为带约为18S带亮度的两倍；

有时也可见带亮度的两倍；

有时也可见5S带带RNA鉴定及初定量鉴定及初定量ElectrophoresisgeloftheRNAsample小结小结RNA的保护的保护1.提取前提取前1.1新鲜样品及液氮速冻新鲜样品及液氮速冻1.2提取工作区提取工作区RNase的清除的清除1.3实验用品实验用品RNase的清除的清除2.提取中提取中2.1组织破碎过程中的保护组织破碎过程中的保护2.2细胞裂解过程中的保护细胞裂解过程中的保护2.3实验人员保护措施实验人员保护措施2.4保存过程中保存过程中3.在后续的逆转在后续的逆转录过程中仍需保录过程中仍需保持无酶环境持无酶环境第二部分第二部分RT-PCR逆转录逆转录PCRreversetranscriptionAAAAAAAAAA-3TTTTTTTTTT-5mRNA（sense）Antisenseprimers:

oligo（dT）orrandomhexamersorGSP1ststrandcDNAAAAAAAAAAA-3TTTTTTTTTT-5PCRusingGSP+GSP1GSP1GSPGSP1（sense）GSP（antisense）1ststrandcDNART-PCR逆转录逆转录选择选择方法方法：

两步法两步法（适用于多目的基因）（适用于多目的基因）一步法一步法（适用于单一目的基因）（适用于单一目的基因）RNA逆转录逆转录选择选择逆转录引物逆转录引物：

随机引物随机引物（适用于低丰度（适用于低丰度RNA）Oligo（dT）引物引物（适用于具有（适用于具有PolyA尾的尾的RNA）特异性引物特异性引物（适用于一步法）（适用于一步法）RNA逆转录步骤逆转录步骤

（1）取）取1-5ugRNA样本，样本，65热变性热变性10min；

（2）配制反应体系，共）配制反应体系，共20ul（以（以AMV为例）为例）10buffer2ulMgcl2（25mM）4uldNTPs（10mM）2ulRNaseinhibitor（1U/ul）0.5ulreversetranscriptase15Ureverseprimer0.5ugRNAsample1-5ugRNase-freeWater加至加至20ul一、逆转录反应一、逆转录反应RNA逆转录步骤逆转录步骤（3）反应体系）反应体系42孵育孵育60min。

如使用随机引物，先室温孵育。

如使用随机引物，先室温孵育10min后，再升温至后，再升温至42。

（4）72，5min失活酶，置冰进行后续反应或失活酶，置冰进行后续反应或-20保存。

cDNA第一链已合成，可低温保存或继续后续实验第一链已合成，可低温保存或继续后续实验聚合酶链式反应聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）以母链以母链DNA为模板为模板，以，以特定引物特定引物为延伸起点，为延伸起点，以反应底物以反应底物脱氧核糖核苷三磷酸脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）在在DNA聚合酶聚合酶催化催化下，通过下，通过变性、退火、延伸变性、退火、延伸等等步骤，步骤，体外复制体外复制出与母链模板出与母链模板DNA互补的子链互补的子链DNA的过程。

的过程。

PCR的原理和反的原理和反应过程程RT-PCR逆转录逆转录PCRPCR反应准备工作：

反应准备工作：

目的基因目的基因扩增引物扩增引物设计：

设计：

NCBI中查询靶基因的中查询靶基因的mRNA序列，无特序列，无特殊要求可选择殊要求可选择CDS序列作为引物设计区域。

序列作为引物设计区域。

RT-PCR逆转录逆转录PCRmRNA序列查找（以序列查找（以EGFR为例）为例）RT-PCR逆转录逆转录PCR以以BLAST验证引物验证引物RT-PCR逆转录逆转录PCRPCR反应准备工作：

选择选择内参内参：

1.受不同实验处理因素时，表达恒定；

受不同实验处理因素时，表达恒定；

2.在体内各种组织中表达恒定；

在体内各种组织中表达恒定；

3.除实验设计处理因素之外，能够与目的基因除实验设计处理因素之外，能够与目的基因一起受同等程度的非设计其它因素影响。

一起受同等程度的非设计其它因素影响。

常用内参基因名称：

-actin、GAPDH、16Sr、18Sr（Human、Rat、Mouse）RT-PCR逆转录步骤逆转录步骤二、二、PCR扩增扩增（示例）（示例）1.cDNA第一链第一链2ul2.10PCRbuffer（K+）5ul3.25mMMgCl23ul（1.5mM）4.10mMdNTPs1ul（各各200uM）5.50M引物引物正向正向/反向反向各各0.5ul（0.10.5uM）6.Taq酶酶0.5ul（15U）7.双蒸水双蒸水38.5ul总反应体积：

总反应体积：

50ulPCRmix包含：

包含：

buffer（Mg2+）dNTPsTaq酶酶RT-PCR逆转录步骤逆转录步骤PCR反应条件反应条件952min9530sec40-