Western Blot 操作文档格式.docx
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各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器材;
PVDF膜,乳胶手套,保鲜膜,搪瓷盘(>
20×
20cm),X-光片夹,X-光片,玻棒长短各一根,计时器,吸水纸,
试剂配制:
1.0mol/LTris·
HCl
Tris(MW121.14)30.29g
蒸馏水200ml
溶解后,用浓盐酸调pH至所需点(见下所示),最后用蒸馏水定容至250ml,高温灭菌后室温下保存。
PHHCl
7.4约17ml
7.5约16m
7.6约15ml
8.0约10ml
10%SDS
SDS10g
蒸馏水至100ml
50℃水浴下溶解,室温保存。
如在长期保存中出现沉淀,水浴溶化后,仍可使用。
10%过硫酸胺(APS)
过硫酸胺0.1g
超纯水1.0ml
溶解后,4℃保存,保存时间为1周。
1.5mol/LTris·
HCl(pH8.8)
Tris(MW121.14)45.43g
超纯水200ml
溶解后,用浓盐酸调pH至8.8,最后用超纯水定容至250ml,高温灭菌后室温下保存。
0.5mol/LTris·
HCl(pH6.8)
Tris(MW121.14)15.14g
溶解后,用浓盐酸调pH至6.8,最后用超纯水定容至250ml,高温灭菌后室温下保存。
30%Acr
丙稀酰胺(Acr)29g
甲叉双丙稀酰胺(Bic)1g
超纯水至100ml
溶解后,0.45μm滤膜过滤后4℃保存。
使用时恢复至室温且无沉淀。
0.01mol/LPBS(pH7.2-7.4)
Na2HPO42.9g
KH2PO40.2g
NaCl8g
KCl0.2g
蒸馏水至1000ml
12%分离胶和5%浓缩校
10mL12%分离4mL5%浓缩胶
超纯水3.3ml2.7ml
30%Acr4.0ml0.67ml
1.5mol/LTris·
HCl(pH8.8)2.5ml-
1.0mol/LTris·
HCl(pH6.8)-0.5ml
10%SDS100l40l
10%AP(过硫酸胺)100l40l
TEMED4l4l
加TEMED后,立即混匀即可灌胶。
还原型2XSDS上样缓冲液
1.0mol/LTris·
HCl(pH6.8)0.5ml
SDS0.2g
溴酚蓝10mg
甘油1.0mL
DTT,MW154.5)0.39g
临用前取1.0mol/L贮存液DTT1.0mL加入4.0mL2XSDSloadingbuffer,混匀后,分装于1.5ml离心管中,4℃保存,一周内用完。
DTT
DTT5.0g
DDW32.4Ml
分成小份,-20度保存。
5*Tris-GlycineBuffer电泳液缓冲液
Tris(MW121.14)15.1g
甘氨酸(MW75.07)94g
SDS5.0g
溶解后室温保存,次溶液可重复使用3~5次。
10*转移缓冲液
甘氨酸(MW75.07)14.5g
Tris(MW121.14)29g
SDS0.5g
蒸馏水至500ml
溶解后室温保存,临用前取200mL甲醇加入800mL转膜缓冲液中共1000mL。
次溶液可重复使用3~5次。
TBS缓冲液
1mol/LTris·
HCl(pH7.5)10ml
NaCl8.8g
蒸馏水至1000ml
TBST缓冲液(含Tween20的TBS缓冲液)
0.05%Tween200.25ml
TBS500ml
混匀后即可使用,最好现用现配。
1*TBST1L
Trisbase2.422g(MW121.4)
Nacl8.775g
Tween200.5ml
封闭液(含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液)
脱脂奶粉(国产,安怡牌)5g
TBST100mL
溶解后4℃保存。
使用时,恢复室温,用量以盖过膜面即可,一次性使用。
显影液
一小袋溶于250mLDDW中,棕色瓶保存。
定影液
一盒溶于1000mLDDW,室温棕色瓶保存。
抗体
用封闭液稀释至一定浓度使用,每张膜需0.5ml。
ECL化学发光试剂
购自碧云天,分A和B两种试剂。
操作步骤:
(一)SDS-PAGE电泳
(1)清洗玻璃板:
一只手扣紧玻璃板,另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲,再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
(2)灌胶与上样
1玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
(操作时要使两玻璃对齐,以免漏胶。
)
2按前面方法配12%分离胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时,可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出,待胶面升到绿带中间线高度时即可。
然后胶上加一层水,液封后的胶凝的更快。
(灌胶时开始可快一些,胶面快到所需高度时要放慢速度。
操作时胶一定要沿玻璃板流下,这样胶中才不会有气泡。
加水液封时要很慢,否则胶会被冲变型。
3当水和胶之间有一条折射线时,说明胶已凝了。
再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
4按前面方法配5%的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
插梳子时要使梳子保持水平。
由于胶凝固时体积会收缩减小,从而使加样孔的上样体积减小,所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。
待到浓缩胶凝固后,两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
5用水冲洗一下浓缩胶,将其放入电泳槽中。
(小玻璃板面向内,大玻璃板面向外。
若只跑一块胶,那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。
6测完蛋白含量后,计算含50g蛋白的溶液体积即为上样量。
取出上样样品至0.5ml离心管中,加入5×
SDS上样缓冲液至终浓度为1×
。
(上样总体积一般不超过15l,加样孔的最大限度可加20l样品。
)上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白变性。
7加足够的电泳液后开始准备上样。
(电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。
)用微量进样器贴壁吸取样品,将样品吸出不要吸进气泡。
将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。
(加样太快可使样品冲出加样孔,若有气泡也可能使样品溢出。
加入下一个样品时,进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次,以免交叉污染。
(3)电泳
电泳时间一般4~5h,电压为40V较好,也可用60V。
电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳,进行转膜。
(二)转膜
(1)转一张膜需准备2张7.0~8.3cm的滤纸和1张7.3~8.6cm的硝酸纤维素膜。
切滤纸和膜时一定要戴手套,因为手上的蛋白会污染膜。
将切好的硝酸纤维素膜置于转膜缓冲液中浸15min才可使用。
(用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里,要使膜浮于水上,只有下层才与水接触。
这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。
若膜沉入水里,膜与水之间形成一层空气膜,这样会阻止膜吸水。
(2)在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。
(3)将夹子打开使黑的一面保持水平。
在上面垫一张海绵垫,用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。
(一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。
)在垫子上垫一层滤纸,一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。
(4)要先将玻璃板撬掉才可剥胶,撬的时候动作要轻,要在两个边上轻轻的反复撬。
撬一会儿玻璃板便开始松动,直到撬去玻板。
(撬时一定要小心,玻板很易裂。
)除去小玻璃板后,将浓缩胶轻轻刮去(浓缩胶影响操作),要避免把分离胶刮破。
小心剥下分离胶盖于滤纸上,用手调整使其与滤纸对齐,轻轻用玻棒擀去气泡。
将膜盖于胶上,要盖满整个胶(膜盖下后不可再移动)并除气泡。
在膜上盖3张滤纸并除去气泡。
最后盖上另一个海绵垫,擀几下就可合起夹子。
整个操作在转移液中进行,要不断的擀去气泡。
膜两边的滤纸不能相互接触,接触后会发生短路。
(转移液含甲醇,操作时要戴手套,实验室要开门以使空气流通。
(5)将夹子放入转移槽槽中,要使夹的黑面对槽的黑面,夹的白面对槽的红面。
电转移时会产热,在槽的一边放一块冰来降温。
一般用60V转移2h或40V转移3h。
(6)转完后将膜取出,可以看到预染Marker已经转印到膜上了,这个过程要保证膜的湿润,不能干燥,否则会产生较强的非特异性。
膜一:
A1B1C1D1A2B2C2D2A3B3C3D3
2
1
5
3
膜二:
1Occluding65kD
2ZO-1220kD
3Claudin-122kD
4Claudin-422kD
5JAM-A36-41kD
6PKC80kD
7UGT64kD
内参βactin42kD
分别将目的蛋白周围的膜切开,以DDW冲洗。
分别加入相应一抗。
(三)免疫反应
(1)将膜用TBS从下向上浸湿后,移至含有封闭液的平皿中,室温下脱色摇床上摇动封闭1h。
(2)将一抗用TBST稀释至适当浓度(在1.5ml离心管中);
撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上,四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整;
将抗体溶液加到保鲜膜上;
从封闭液中取出膜,用滤纸吸去残留液后,将膜蛋白面朝下放于抗体液面上,掀动膜四角以赶出残留气泡;
室温下孵育1~2h后,用TBST在室温下脱色摇床上洗两次,每次10min;
再用TBS洗一次,10min。
(3)同上方法准备二抗稀释液并与膜接触,室温下孵育1~2h后,用TBST在室温下脱色摇床上洗两次,每次10min;
再用TBS洗一次,10min,进行化学发光反应。
(四)化学发光,显影,定影
(1)将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合;
1min后,将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触;
1min后,将膜移至另一保鲜膜上,去尽残液,包好,放入X-光片夹中。
(2)在暗室中,将1×
显影液和定影液分别到入塑料盘中;
在红灯下取出X-光片,用切纸刀剪裁适当大小(比膜的长和宽均需大1cm);
打开X-光片夹,把X-光片放在膜上,一旦放上,便不能移动,关上X-光片夹,开始计时;
根据信号的强弱适当调整曝光时间,一般为1min或5min,也可选择不同时间多次压片,以达最佳效果;
曝光完成后,打开X-光片夹,取出X-光片,迅速浸入显影液中显影,待出现明显条带后,即刻终止显影。
显影时间一般为1~2min(20~25℃),温度过低时(低于16℃)需适当延长显影时间;
显影结束后,马上把X-光片浸入定影液中,定影