微生物限度检查标准操作规程Word文档格式.docx

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3.2.3检验

3.2.3.1供试品检验项目按《中国药典》2010年版二部微生物限度标准确定。

3.2.3.2检验的全过程，均应严格遵守无菌操作，严防再污染。

3.2.3.3除另有规定外，供试品制备成供试液后，应在均匀状态取样。

3.2.3.4制成供试液后，应该在60分钟内注皿操作完毕。

3.2.4培养

3.2.4.1除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30～35℃，霉菌、酵母菌培养温度为25～28℃，控制菌培养温度为36℃±

1℃。

3.2.5复检

3.2.5.1菌数测定不合格者应复检，控制菌检查以一次检出为准，不再复试，但应保留检出菌株一个月备查。

3.2.5.2复试项目以不合格项目为准，作单项复试。

3.2.5.3复试需另取同批号样品，复试2次。

3.2.5.4复试报告，以3次测定结果的平均值报告。

3.2.6检验报告

3.2.6.1检验报告以1g、1ml或10cm2为单位。

3.2.6.2测定菌数报告，依3.10.2.4菌数报告规则报告。

3.2.6.3控制菌按检验结果报告，如未检出控制菌时，报告为“按规定抽样检验结果未检出×

×

菌”，如抽样中任意一样品检出控制菌时，报告为“按规定抽样，检出×

菌，不符合药品微生物限度标准”。

3.3培养基及其制备方法

3.3.1营养琼脂培养基

取营养琼脂培养基34g，加1000ml水，加热溶解，分装，116℃高压灭菌20分钟。

3.3.2玫瑰红钠琼脂培养基（虎红琼脂培养基）。

取玫瑰红钠琼脂培养基30g，加1000ml水，加热溶解，分装，116℃高压灭菌20分钟。

3.3.3胆盐乳糖培养基（BL）

取胆盐乳糖培养基36g，加1000ml水，加热溶解，分装，116℃高压灭菌20分钟。

3.3.4麦康凯琼脂培养基（MacC）

取麦康凯琼脂培养基54g，加1000ml水，加热溶解，分装，116℃高压灭菌20分钟。

3.3.5磷酸盐葡萄胨水培养基15.8g，加1000ml水，加热溶解，分装，116℃高压灭菌20分钟。

3.3.6蛋白胨水培养基

取蛋白胨水培养基15g，加1000ml水，加热溶解，分装，116℃高压灭菌20分钟。

3.3.7枸橼酸盐培养基

取枸橼酸盐培养基22g，加1000ml水，加热溶解，分装，116℃高压灭菌20分钟。

3.3.84-甲基伞形酮葡萄苷酸培养基（MUG）

取4-甲基伞形酮葡萄苷酸培养基35g，加1000ml水，分装，115℃高压灭菌20分钟。

注：

培养基（生物试剂）中国药品生物制品检定所生产。

3.4试液

3.4.10.1%2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液。

3.4.1.1配制：

取2，3，5-氯化三苯基四氮唑0.1g溶于100ml水，灭菌，备用。

3.4.1.2用途：

供制备培养基用。

3.4.2无菌对氨基苯甲酸试液

3.4.2.1配制：

取对氨基苯甲酸0.1g，加入含10ml水的具塞试管中，121℃灭菌20分钟。

3.4.2.2用途：

供磺胺类药物检验用。

3.4.3氢氧化钾试液

3.4.3.1配制：

取氢氧化钾40g，加水溶解使成100ml。

3.4.3.2用途：

供作V-P反应试剂。

3.4.4-萘酚乙醇溶液

3.4.4.1用途：

3.4.5靛基质试液

3.4.5.1取对二甲氨基苯甲醛5.0g，加入戊醇（或正丁醇）75ml，充分振摇，使完全溶解后，再取浓盐酸25ml徐徐滴入，边加边振摇，以免骤热导致溶液色泽变深，或取对二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95%乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取浓盐酸20ml徐徐滴入。

3.5稀释剂

3.5.10.9%无菌氯化钠溶液

取氯化钠9.0g，加水溶解使成1000ml，121℃灭菌20分钟。

3.5.2无菌磷酸盐缓冲液（PH7.2）

取磷酸氢二钠25.8g与磷酸二氢钠4.4g，加水稀释至1000ml，121℃灭菌20分钟。

3.6指示液

3.6.1甲基红指示液

取甲基红0.1g，加95%乙醇300ml，使溶解后，加水至500ml，即得。

3.6.2溴麝香草酚蓝指示液

取溴麝香草酚蓝0.4g，加1mol/L氢氧化钠溶液0.64ml使溶解，再加水至100ml，变色范围6.0～7.6（黄—蓝）

3.7供试品的检验量：

3.7.1每批供试品检验量一般为10g或10ml，化学膜剂为100cm2，贵重的或微量包装的供试品检验量可酌减，但口服药品不得少于3g，外用药品不得少于5g。

3.7.2供试品须取自2个以上的包装单位。

3.8供试液的制备

3.8.1液体供试品：

取供试品10ml，加入稀释剂90ml，混匀，作为供试液。

3.8.2固体供试品：

取供试品10g，置0.9%无菌氯化钠溶液100ml中，用匀浆仪或其他适宜方法混匀后，作为供试液。

3.8.3肠溶胶囊（片）供试品：

取供试品10g，置含有无菌磷酸盐缓冲液（PH6.8）100ml的锥形瓶内，于45℃水浴中，保温，振摇，使溶解，作为供试液。

3.8.4含抑菌成分供试品的供试液制备方法：

3.8.4.1离心沉淀法：

可溶性供试液：

取供试液10ml，置入刻度离心管中，以3000转/分以上离心沉淀30分钟，用毛细管吸取上清液弃掉，留下管底约2ml残余液，将其全部洗入增菌培养基中，作控制菌检查。

混悬供试液：

取供试液10ml，置刻度离心管中，先以500转/分离心沉淀5分钟，取其上清液移入另一离心管中，再经3000转/分以上离心沉淀30分钟，弃去上清液，保留约2ml残余液，全部洗入增菌培养基中，作控制菌检验。

3.8.4.2钝化剂中和法：

磺胺类药物中和法：

取规定量的供试液，加入含有无菌1%对氨基苯甲酸试液0.5ml的100ml增菌液中，作增菌培养即可。

3.8.4.3沉降法：

取规定量的供试液，自然沉降5分钟，吸取上层液于含1%的对氨基苯甲酸1ml的增菌液，作增菌培养即得。

3.8.4.4稀释法

将供试液种入较大量的培养基中，使该供试液稀释至不具有抑菌作用的浓度。

3.9对照试验：

3.9.1.1阴性对照试验：

测试检验全过程中无菌技术的可靠性。

3.9.1.2控制菌检验阴性对照试验：

供试验用稀释剂10ml于增菌液中，按控制菌检验方法检查，无菌生长。

3.9.2阳性对照试验：

检查供试品是否对控制菌生长产生干扰作用及检查培养条件是否适宜。

3.9.2.1阳性对照试验：

方法同供试品检验，于供试液中加入一定量（50～100）的相应对照菌，作为阳性对照试验。

3.9.2.2对照用菌株：

大肠杆菌[CMCC（B）44102]、沙门菌[CMCC（B）50094]

3.9.2.3对照用菌液的制备：

取阳性菌株的营琼脂培养基斜面新鲜培养物1白金耳，接种至营养肉汤培养基内，培养18～20小时后，稀释至10-6～10-7。

对照菌的加入量为50～100个。

（取稀释液1ml注皿测定菌落数）

3.9.2.4当供试品未检出控制菌时，而阳性对照试验也未能检出，不能做出供试品未检出控制菌的结论。

3.9.2.5阳性对照试验操作必须与供试品检验操作严格分开，避免交叉污染。

3.10检查法：

3.10.1检查前的准备：

3.10.1.1用具的洗涤与灭菌。

（a）试管：

使用过的试管经消毒后，将培养基倒出，用清洁液洗刷，用水冲洗4-5次，倒立，晾干备用。

灭菌前，用棉塞塞上管口，牛皮纸包紧，扎紧。

（b）吸管：

使用过的吸管用清洁液浸泡数分钟后，用水冲洗4-5次，晾干，备用。

灭菌前，在吸管上端距0.5cm处塞入约2cm左右的适当疏松棉花，用牛皮纸裹紧。

（c）研钵：

使用过的研钵用清洁液洗刷后，用水冲洗数次，晾干备用。

灭菌前，用牛皮纸将钵体和锤包裹。

（d）培养皿：

使用过的培养皿经消毒后，将培养基倒出，用清洁液洗刷，用水冲洗4-5次，倒立、晾干备用。

灭菌前，根据消毒器内经大小用牛皮纸包数个培养皿，扎紧。

（e）将上述包好的用具，放在121的高压蒸汽消毒器中，灭菌30min后，放入微生物限度检查室定点位置，备用。

3.10.1.2将所有已灭菌的培养皿、三角瓶、吸管（1ml、10ml）、稀释剂及供试品等移至无菌室内。

每次试验所用物品必须事先计划，准备足够用量，避免操作中出入操作间。

将全部包装（牛皮纸）去掉，编号。

3.10.1.3开启无菌室紫外线杀菌灯和空气过滤装置并使用其工作30min。

3.10.1.4操作人员用肥皂洗手，关闭紫外线杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋，再用0.1%新洁尔灭或用75%乙醇棉球擦手，待干后，穿戴无菌衣、帽、口罩。

3.10.1.5操作前先用75%乙醇棉球擦手，并擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口周围，待干后将供试品瓶、盒、袋启封，启封后先检查瓶盖内侧及瓶口周围有无生霉、长螨的迹象，对肉眼可见疑似者，若经证实为生霉、长螨即可判定为不合格，无须继续检验。

3.10.2细菌、霉菌、酵母菌计数。

3.10.2.1检验程序：

干燥

3.10.2.2操作步骤：

（a）供试液制备：

经阴性对照取样后，按各类制剂制备供试液的方法制备。

（b）稀释及取样

稀释：

取1ml吸管1支，吸取混匀的1:

10供试液（或原液，1:

20供试液）1ml，在离稀释剂液面上约1cm处，测管壁注入装有9ml的稀释剂的的试管中，混匀成1:

100（或1:

10，1:

200）的稀释液。

吸样：

用上述吸管分别取1:

20供试液）1ml，注入2～3个平皿中，以另一支1ml吸管，按上述操作下一级的稀释与吸取。

（c）注皿与干燥

事先将培养基融化，置45℃水浴中，备用，当供试液及各稀释液均注入平皿后，以上述培养基倾注入平皿，每平皿约15ml，转动平皿，使样液与培养基混匀后，置水平台上待凝。

培养基凝固后，在净化条件下开盖倒置或换灭菌的陶瓦盖，使平板干燥，减少平板表面的水分，防止菌落蔓延生长，干燥时间一般在3h左右，干燥时间计入培养时限。

（d）培养：

将上述平板倒置于适宜温度的培养箱中，培养。

细菌于30~35℃培养48±

2小时，霉菌于25~28℃培养72±

2小时。

3.10.2.3菌落计数：

（a）用肉眼直接计数，标记或在菌落计数器上点计，然后用5-10倍放大镜检查，是否遗漏。

（b）若平板上有2个或2个以上的菌落重叠，肉眼可分辨时，仍以1个或2个以上菌落计数。

（c）平板上有片状菌落或花斑样菌落蔓延生长以及平板受到污染的情况，该平板计数无效。

（d）当同一稀释级使用2个平板时，应采用2个平板菌落数的均值为平均平板菌落数，若2个平板菌落数相差在1倍以上时，该稀释级不宜采用，但不包括2个平板菌数均在15个以下的情况（15个