细胞代谢产物提取物中分解产物的鉴定_精品文档.doc

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细胞代谢产物提取物中分解产物的鉴定

摘要：

分析细胞代谢产物的方法大多数都需要从细胞中提取代谢产物。

这些方法关注的是由于提取不完整造成对代谢水平的估计不足。

然而，通过这些提取方法的比较，似乎提取一个特定的代谢产物最好的方法是使产量达到最大。

在以不同浓度甲醇水溶液提取大肠杆菌的实验中：

通过液相色谱-串联质谱法对提取结果进行分析，我们观察到使用含水量≥50%的溶液进行提取得到的核苷和碱基的产量比使用含水量≤20%的溶液进行提取要高。

然而，在提取物中添加标记了同位素的核苷进行示踪显示，核苷和碱基的高产量是由于核苷和核苷酸在水分充足条件下分解导致的，而不是因为采用了良好的提取方法。

同位素示踪标记法是检测细胞代谢物提取物中分解产物普遍采用的一个方法。

甲醇水溶液提取大肠杆菌实验中，低温和高浓度的甲醇最大限度的降低了代谢物的分解。

关键词：

代谢组学；新陈代谢；提取；细菌；取样；稳定性；液相色谱-质谱/质谱法；三重四极杆；小分子

细胞代谢网络在生物学，将吸收的营养物质转化成能源，生物大分子亚基和信号分子中起着基础性作用。

由于这些过程的重要性，人们对尽可能完整的理解细胞代谢活动有很大的兴趣。

为此，在过去5年研究中，在并行文献中看到试图对细胞代谢网络的许多组成成分的研究显著加快，普遍关注的是通过改变营养状况造成细胞环境的扰动而导致代谢产物浓度的定量变化。

代谢产物分析遇到的一个长期挑战是从生物样品中提取感兴趣的化合物。

尽管避免了需要通过直接在居住环境范围内对感兴趣的分析物进行提取来衡量，这种可能性是很吸引人的（例如，采用核磁共振[NMR]），绝大多数的代谢产物分析仍继续通过提取完成。

提取物的使用在样品的浓缩和分离中具有重要优势。

此外，使用质谱（MS）有利于分析，质谱对于从复杂的混合物中鉴定和定量低含量的组成成分来说是一项独特的强大技术。

在努力使基于细胞的代谢更加定量和系统的一部分研究中，已经有越来越多的研究来确定适合广泛的代谢产物谱的提取条件，同时也了解这些提取过程的局限性。

例如，Maharjan和Ferenci采用薄层色谱法分析放射性标记的样本，研究了分别以沸乙醇水溶液，冷甲醇水溶液和热甲醇水溶液，冷高氯酸溶液和冷氢氧化钾水溶液提取大肠杆菌的效率。

根据其得到最高数量代谢产物的提取方法的产量最高，同时也能够避免高温或极端PH的直接影响，他们发现冷甲醇水溶液法（他们以50:

50混合进行实验）是最好的方法。

随后，Villas-Boas和他的同事在酿酒酵母中进行了相关实验。

相对于侧重细胞原料的提取，取而代之的是他们使用气相色谱—质谱法作为检测方式测量了加入示踪同位素标记的代谢产物的复原，发现冷的纯甲醇法使代谢产物损失降到最低，这是Maharjan和Ferenci没有探索出的条件。

基于这些结果以及我们自己的研究，我们首先使用冷的80:

20甲醇水溶液提取细菌沙门氏菌，平行提取三次以提高代谢产物总产量。

在三次提取结束后，随后使用其他的混合溶剂进行提取，大部分代谢产物没有大量产生，通过这我们有理由证明此过程的有效性。

虽然之前的这些研究在确定适合以细胞为基础的代谢组学的提取方法方面取得了很大进展，但是他们没有回答如何判断一个提取方法这一根本问题。

获得尽可能多的可测定数量的内源性代谢物是重要的特点？

它能使具体的关键代谢产物产量最大化？

它能最大限度的减少标准代谢产物的损失？

没有额外的代谢产物，提取能得到更高的提取产量？

为进一步优化内源性代谢产物的提取，我们在不同条件下提取大肠杆菌，与一些最初探索使用冷甲醇水溶液提取条件不同的是，我们使用的水分含量不同。

我们惊奇的发现，甲醇含量从80%至50%明显的改变了代谢物结构，在使用80%甲醇溶液提取的结果中核苷酸含量丰富，同时核苷和碱基在50%甲醇中含量更高。

这就提出了以下问题：

80%和50%的甲醇水溶液哪一个是较优的提取溶剂？

利用同位素示踪标记的方法，我们得出一个明确的答案：

甲醇含量高的溶液是较优的提取溶剂，因为在水分含量充足条件下核苷和碱基的提取效果明显“好”，实际上是由于核苷酸的分解。

这一研究结果强调了选择提取方法的重要性，正确的提取方法能由生产出的产品反映真正的细胞内环境，而不仅仅是产生大量的代谢产物。

材料和方法

化学药品

VWR国际公司（西切斯特，宾夕法尼亚州，美国）生产的HPLC级溶剂（全溶剂，易安迪化学试剂，吉布斯顿，新泽西州，美国），万灵科化学品公司（菲利普斯堡，新泽西州，美国）生产的乙酸铵（纯度99.4%）和飞世尔科技（匹兹堡，宾夕法尼亚州，美国）生产的氢氧化铵（纯度29.73%）。

所有的纯代谢物标准品和媒介组分都来自西格玛-奥德里奇公司（圣路易斯，密苏里，美国），而且从制造商得知它们的纯度都≥98%。

剑桥同位素实验室（安多弗，马萨诸塞，美国）提供的U-13C标记的葡萄糖（纯度99%）。

细胞生长和提取

所有试验中均使用大肠杆菌K-12菌株NCM3722。

细胞在37℃下，以10mM的氯化铵为氮源和0.4%葡萄糖（未标记或完全由13C标记）为碳源，含盐量最小的摇床瓶中生长。

当吸光值在650nm（A650）处达到约0.35时，将指数生长期的细胞培养淬灭并进行提取。

根据改变后的Lu和他的同事最初提出的基本方案，代谢产物在如结果所描述的具体浓度甲醇水溶液和变化的提取温度条件下被连续提取。

5000克细菌离心沉淀4分钟，立即弃去上清液，向沉淀中加入300μL甲醇水溶液并混合均匀，淬灭新陈代谢并开始提取。

15分钟后，样品在微型离心机中以4℃，13200r/min离心5分钟，弃去水溶性提取物。

按照上面的方法重复提取沉淀，除了添加200μL甲醇水溶液外再合并提取液。

然后进行第三次提取沉淀，再添加200μL甲醇水溶液，并且将最后一次的提取液与前两次的结合共得到700μL提取液，用于分析。

标准12C标记的同位素示踪法

在提取开始时13C标记的细胞中加入未标记12C的标准同位素示踪剂，目的就是确定它们在提取过程中因吸收，固定，或分解作用所导致的被示踪标准物的可能损失，也为了确定被示踪标准物中任何分解产物的产生。

大肠杆菌在上面描述的U-13C标记的葡萄糖中生长至少20代。

以指数增长的13C标记细胞离心沉淀后，加入300μL含有市售非标记化合物的混合物的萃取溶剂，淬灭新陈代谢并开始提取。

之后提取过程按照上述全过程重复进行一次，没有额外添加标准化合物，最终得到700μL提取液。

在示踪条件下，选择加标提取溶剂中的代谢物浓度进行比较，标准12C标记的信号与13C标记的内源性代谢物的信号大致相当。

在700μL总提取液中加标化合物及其最终浓度分别是5-甲基四氢叶酸（5-MTHF，0.015μg/mL），乙酰辅酶A（乙酰-CoA，5μg/mL），丙氨酸（0.15μg/mL），5’-胞苷三磷酸腺苷（CTP，1μg/mL），果糖-1，6-二磷酸（FBP，1μg/mL），谷氨酰胺（0.03μg/mL），5’-鸟苷三磷酸腺苷（GTP，1μg/mL），5’-肌苷单磷酸腺苷（IMP，1μg/mL），S-腺苷甲硫氨酸（SAM，0.3μg/mL），色氨酸（0.15μg/mL），5’-胸苷三磷酸腺苷（TTP，2μg/mL），5’-尿苷单磷酸腺苷（UMP，1μg/mL），缬氨酸（0.15μg/mL），和黄苷（1μg/mL）。

液相色谱-串联质谱法

把Bajad和他的同事描述的步骤进行些许改变对样品进行分析，涉及到通过液相色谱-串联质谱法，使用三重四极杆仪器在选定反应监测模式模式下操作，对一系列预知的代谢物进行检测。

选定反应监测模式包括从一个给定的母体中检测产生的特定产物。

每一种化合物都是从它的色谱保留时间，母体质量和产品质量的综合来鉴定的。

以12C与13C形式给定的代谢产物在不同的选定反应监测模式扫描过程下进行独立测量，通过不同的选定反应监测模式快速扫描，在一个单一色谱中能获得许多化合物的数据（例如，20-100）。

详细分析如下。

液相色谱条件是在碱性PH条件下使用一个氨丙基亲水作用色谱柱（填料粒度5μm,柱尺寸50´2mm，飞诺美公司，托兰斯，加利福尼亚州，美国）。

色谱柱为高效液相色谱（HPLC）系统（岛津，哥伦比亚，马里兰州，美国），自动进样器温度4℃，柱温15℃，进样体积10μL。

溶剂A为20mM醋酸铵和20mM氢氧化铵的5%乙腈水溶液，PH9.3。

溶剂B为乙腈。

每一个样品跑两次：

一次在阳离子模式下进行，另一次在阴离子模式下进行。

在阳离子模式下，洗脱梯度为：

0min，85%B；3min，45%B；10min，0%B；22min，0%B；23min，85%B；29min，85%B；溶剂流动速度为：

0min，100μL/min；18min，100μL/min；20min，200μL/min；27min，200μL/min；27.1min，100μL/min；29min，100μL/min。

在阴离子模式下，洗脱梯度为：

0min，85%B；3min，45%B；10min，0%B；20min，0%B；21min，85%B；27min，85%B；溶剂流动速度为：

0min，100μL/min；16min，100μL/min；18min，200μL/min；25min，200μL/min；25.1min，100μL/min；27min，100μL/min。

.质谱分析是采用高效液相色谱串联质谱连用超三重四极杆质谱仪（美国热电，圣荷塞，加利福尼亚州，美国）进行的。

阳离子模式下的电喷雾离子电压是3200V，阴离子模式下是3000V。

氮气在压力30磅时被作为鞘气，在10磅时被作为辅助气体，氩气在毛细管温度为325℃，压强1.5mTorr时被作为碰撞气体。

在扫描宽度为1m/z时，每个选定反应监测模式转换的扫描时间是0.1S。

这里报道的关于每个化合物的特定的选定反应监测模式参数都是由Bajad和他的同事提供的。

结果

.甲醇与水的比例对内源性代谢物产量的影响

图1对甲醇水溶液用于提取时得到的大肠杆菌中约100种不同代谢产物的产量进行比较。

每幅图的X轴表示以80%甲醇水溶液，也就是我们在先前研究中使用的甲醇水比例，进行提取时可测得的化合物的产量。

每幅图的Y轴分别表示以100%，50%，20%甲醇水溶液进行提取时的产量。

不考虑混合溶剂的影响，产量相同的化合物会落在同一条线上。

线右下方的点表明80%甲醇水溶液中的化合物相比较来说比另一条件中的丰富，反之亦然；仅存在于一个条件下的化合物落在了坐标轴上。

远离特定直线的化合物（即那些对提取溶剂特别敏感的化合物）被标记出来了。

对于每个混合溶剂，首次提取都在最低温度下进行，因为在最低温度下能使提取最易进行而不会导致溶剂冻结（100%和80%甲醇溶液为-75℃，50%甲醇溶液为-20℃，20%甲醇溶液为4℃），后两次提取都在4℃下进行。

选择使第一步提取在尽可能冷的条件下进行是为了使新陈代谢快速淬灭。

由图1看出的第一个关键点就是，20%和50%甲醇水溶液的提取结果与80%和100%甲醇水溶液的提取结果显著不同，而它们之间又相当类似。

看出的第二个关键点是在含水量高和含水量低的情况下得到的提取物有些在本质上有很大不同；在水分含量高的条件下，尤其是在50%甲醇溶液中含量最丰富的化合物大部分是核苷（腺苷，鸟苷，胞苷，尿苷和胸苷）和碱基（腺嘌呤，鸟嘌呤和胞嘧啶），而含量最少的化合物大部分是核苷酸（胞苷三磷酸，胞苷单磷酸，次黄苷三磷酸，肌苷单磷酸，尿苷三磷酸，尿苷单磷酸，三磷酸腺苷，腺苷一磷酸和黄素腺嘌呤二核苷酸），对于20%的甲醇溶液中，乙酰辅酶A也明显减少。

80%甲醇-75℃/4℃´2

琥珀酰辅酶A

胞苷三磷酸

次黄苷三磷酸

5-甲基四氢叶酸

对羟基苯甲酸酯

肌红蛋白肌醇

80%甲醇75℃/4℃´2

A：

adenosine：

腺嘌呤核苷adenine：

腺嘌呤guanosine：

鸟嘌呤核苷cytidine：

胞嘧啶核苷D-Rib（ul）ose-5-p