钙拮抗剂对大鼠心肌缺血再灌注初期生长反映基因1表达的阻碍Word文档下载推荐.docx

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与I/R组比，维拉帕米组、地尔硫芭卓组和硝苯地平组Egr-1蛋白及Egr-1mRNA表达明显减少（P&

。

结论：

维拉帕米、地尔硫芭卓和硝苯地平都可抑制缺血再灌注心肌Egr-1蛋白及Egr-1mRNA的过度表达。

【关键词】钙拮抗剂；

缺血再灌注；

初期生长反映基因-1

　　［Abstract］Objective:

Tostudytheeffectsofcalciumantagonist（verapamil、diltiazemandnifedipine）onearlygrowthresponsegene-1（Egr-1）expressioninratsaftermyocardialischemia-reperfusion（I/R）.Methods:

RatswererandomlyassignedintoSham、I/R、DMSO、verapamil、diltiazem、nifedipinegroups.TheexpressionlevelsofEgr-1proteinandmRNAwereexaminedbyWesternblotandRT-PCR,respectively.Results:

Comparedwithshamgroup,Egr-1proteinandmRNAofI/Rgroupoverexpressed（P&

.TheexpressionlevelsofEgr-1ofverapamil、diltiazem、nifedipinegroupssignificantlydecreased,comparedwithI/Rgroup（P&

.Conclusion:

Verapamil、diltiazemandnifedipinecaninhibittheoverexpressionofEgr-1proteinandmRNAinratscausedbyI/R.

　　［KeyWords］calciumatagonist;

ischemia-reperfusion;

earlygrowthresponsegene-1

细胞内钙超载是缺血再灌注（I/R）损伤的要紧病理机制之一，而作为组成I/R损伤分子通路一起分子基础的核内转录因子——Egr-1［1］，其与细胞内Ca2+之间存在超级紧密的联系，Ca2+可通过不同的信号转导途径直接或间接阻碍Egr-1的表达。

众所周知，钙拮抗剂防治心肌I/R损伤的要紧机制是阻断心肌细胞膜钙通道，降低细胞内钙离子浓度［（Ca2+）i］，拮抗钙超载。

而咱们的前期工作也证明了F2和维拉帕米均能通过阻断心肌细胞膜钙通道，降低心肌细胞（Ca2+）i，避免钙超载拮抗心肌I/REgr-1的异样表达［2,3］。

因此咱们提出假设：

具有钙拮抗作用的化合物均有抑制Egr-1高表达的效应。

为了验证这一假设，进一步探讨钙拮抗剂的共性作用，本实验通过成立大鼠心肌I/R损伤模型，运用3种经典的钙拮抗剂，观看其对Egr-1mRNA及Egr-1蛋白表达的阻碍，为进一步探讨其分子生物学机制提供有力的依据。

　　1材料与方式

　　动物

SD大鼠｛广州第一军医大学动物中心提供［许可证号：

SCXK（粤）2006-0015,2006B008；

SPF］｝雌雄不拘，体质量250～350g。

　　仪器与试剂

BL-420E信号记录分析系统（四川成都泰盟科技，中国）；

低温高速离心机（Eppendorf公司，德国）；

乳化分析仪（IKA公司，德国）；

聚丙烯酰胺凝胶电泳相关仪器、凝胶成像分析系统、转印系统、紫外分光光度计、全自动PCR扩增仪（Bio-RAD公司，美国）；

压力蒸汽灭菌器（嘉兴市中新医疗仪器，中国）；

电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械厂，中国）；

二甲基亚砜（DMSO，上海凌峰化学试剂，中国）；

兔抗大鼠Egr-1多克隆抗体（SantaCrutz公司，美国）；

HRP标记的山羊抗兔IgG、小鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体、HRP标记2抗IgG（博士德公司,中国）；

硝酸纤维素膜、Trizol试剂、PCR扩增反映试剂盒（Invitrogen公司,美国）；

Egr-1引物和β-actin引物（上海华丽生物工程公司，中国）；

第一链cDNA合成试剂盒（MBIFermentas公司,立陶宛）；

维拉帕米（恒瑞医药股分，中国）；

硝苯地平和地尔硫芭卓（Sigma公司，美国）。

　　心肌I/R模型的成立及分组

大鼠称重,乌拉坦kg）腹腔麻醉，分离气管后当即行正压人工呼吸（频率60次/min，流量2mL/100g）。

从左侧第3、4肋间打开胸腔，暴露心脏，剪破心包膜，用2个小拉钩撑开并向下按压胸廓使心脏暴露于胸腔外，在肺动脉圆锥左缘平左心耳下缘2mm冠状动脉处进针，用5/0丝线穿过心肌层。

结扎冠状动脉时连同直径2mm的塑料胶管一路结扎造故意肌缺血60min，然后解除结扎再灌注180min。

大鼠随机分为I/R组（术前5min予NS1mL/kg，结扎大鼠冠状动脉前降支，60min后松开结扎线，恢复血流，再灌注180min）；

DMSO组（术前5min改NS为DMSO，手术操作同I/R组）；

维拉帕米组（术前5min予维拉帕米kg,用NS稀释，一样依照1mL/kg给予）；

地尔硫芭卓组（术前5min予地尔硫芭卓kg,用NS稀释成1mL/kg给予）；

硝苯地平组（术前5min予硝苯地平kg，用NS稀释成1mL/kg给予）；

假手术组（术前5min予NS1mL/kg，手术时冠状动脉前降支穿线但不结扎，持续观看240min）。

　　Egr-1蛋白测定

取100mg心肌组织块，用干净的剪子将组织于冰上快速剪碎，加入预冷的裂解液［20mmol/LTris·

HCl，150mmol/LNaCl，体积分数1％的TritonX-100，1mmol/L乙二胺四乙酸；

pH］与5μL的ProteaseinhibitorcocktailⅢ，用乳化分散仪将心肌组织于冰上充分匀浆，每一标本匀浆30s冰上静置30s，共匀浆3次，匀浆至无明显组织颗粒为止，冰上静置10min，2655g，离心10min（4℃），弃上清液，加入裂解液200μL，冰上静置裂解2h，期间不断涡旋使其充割裂解，然后15294g，离心20min（4℃），吸取部份上清液用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，部份上清液与5×

上样缓冲液4∶1混合，煮沸5min。

配制分离胶与浓缩胶，然后每一泳道加60μg蛋白样品，电泳（125V，80min），转膜（350mA，60min）。

封锁液封锁1h，加入1∶200Egr-1抗体稀释液，4℃留宿，洗膜3次，每次10min，加1∶1500的2抗稀释液室温孵育2h，洗膜3次，每次10min，滴1∶1Ecl化学发光试剂于膜上，反映1min，压片1min，曝光1min，将胶片进行显影、定影。

　　Egr-1mRNA的测定

取-30℃冰箱保留的100mg心肌组织块，转移到5mL离心管中，每管加入1mLTrizol试剂，用干净的剪子将组织于冰上快速剪碎，用乳化分散仪将心肌组织于冰上充分匀浆，每一标本匀浆30s冰上静置30s，共匀浆3次，匀浆至无明显组织颗粒为止。

然后转移至2mL离心管中，室温静置5min，每管加氯仿，振摇15s，室温静置3min，10621g,离心10min（4℃），吸取上层水相，移至另一新的离心管中，加预冷的等体积异丙醇，-30℃冰箱中静置30min，15294g,离心10min（4℃），弃上清液，加体积分数75%的乙醇1mL，摇振，充分洗涤沉淀，7600g,离心5min（4℃），弃上清液，超净台中干燥2min，沉淀重悬于RNase-free水中，紫外分光光度计测定RNA浓度及A260/A280比值。

提取的总RNA冻存于-70℃冰箱。

采纳第一链cDNA合成试剂盒逆转录合成cDNA。

采纳PCR扩增反映试剂盒合成DNA。

Egr-1引物（512bp）：

上游5′-GCAACACTTTGTGGCCTGAA-3′，下游5′-GAGTTGGGACTGGTAGGTGT-3′；

β-actin引物（380bp）：

上游5′-GTGGGTATGGGTCAGAAGGA-3′，下游5′-AGCGCGTAACCCTCATAGAT-3′。

PCR产物经质量分数1%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像分析系统进行拍照和图像分析。

　　统计学处置

所有计量资料以x±

s表示，采纳单因素方差分析进行组间比较。

　　2结果

　　钙拮抗剂对I/R心肌Egs-1蛋白水平的阻碍

各组均以Egr-1灰度与β-actin灰度比值进行比较。

以I/R组的灰度值为100％，那么假手术组、DMSO组、维拉帕米组、地尔硫芭卓组、硝苯地平组灰度值别离为±

%,±

%，±

%和±

%。

其中，与假手术组比，I/R组和DMSO组Egr-1蛋白表达显著增高（P&

DMSO组与I/R组比无统计学意义；

与I/R组比，维拉帕米组、地尔硫芭卓组及硝苯地平组Egr-1蛋白表达明显减少（P&

，图1）。

　　钙拮抗剂对I/R心肌Egr-1mRNA水平的阻碍

以Egr-1和β-actin光密度值的百分比来反映各组Egr-1mRNA的转录水平。

DMSO组与I/R组比无统计学意义（P&

gt;

图2）。

　　3讨论

　　研究说明，心肌I/R损伤的发生与细胞内、外Ca2+散布的破坏即钙超载紧密相关。

钙拮抗剂通过阻断心肌细胞膜钙通道，降低细胞（Ca2+）i拮抗钙超载医治心肌I/R损伤已成为目前的一种共识［4,5］。

　　Egr-1属于即刻初期基因家族，多种刺激因素（缺血、缺氧等）都可诱导其快速表达。

Egr-1初期被以为与细胞的生长分化及肿瘤发生紧密相关。

除此之外，Egr-1还参与了多种病理生理进程，是多种细胞外环境的刺激信号与靶基因表达之间的耦联分子［6,7］。

Yan等［1］采纳反义寡核苷酸（AS-ODN）技术证明，在未经Egr-1AS-ODN处置的肺组织，I/R进程中，Egr-1表达上调，而异样表达的Egr-1又起着“分子开关”的作用，通过诱导一系列下游基因的表达，最终引发炎症反映、凝血和血管通透性这三大I/R病理损害。

本实验的结果也证明，I/R组的Egr-1蛋白和Egr-1　mRNA的表达水平较假手术组明显升高，提示Egr-1在I/R病理进程中发挥着超级重要的作用。

Ca2+是细胞信号转导进程中最多见的第二信使，细胞（Ca2+）i升高可通过量条途径磷酸化Ca2+灵敏的基因转录序列，进而调剂靶基因的表达。

研究说明，Ca2+可通过磷酸激酶C诱导牛冠状动脉内皮细胞及心肌细胞Egr-1的表达［8］，另外Ca2+也可通过MAPK、Ca2+/CaM依托性蛋白激酶等途径调剂Egr-1表达［9,