PCR荧光检测试剂盒生产质控规程docWord文档下载推荐.docx
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9．配PCR反应液应先加缓冲液再加PCR反应液充分混匀,必要时倒置混匀,
再离心,或用灭菌吸头上下吸几次。
10．PCR反应液（包括样品）应充分混匀:
保证PCR反应曲线呈S形，全阴性样品呈近似水平曲线。
二．PCR试验操作规程
程序
操作
检查
1
混匀方法
每一次提醒注意
倒置混匀、移液器吹打、震荡，50000rpm
离心1分钟。
2
取血清样本
1）因水分蒸发变浓
按
（1）法混匀,再取25μl加水5μl混匀。
2）冻状、混浊
温水浴37℃溶解按
（1）法混匀,或
12000rpm离心5分钟，取清液。
3
取质控品
冻状、混浊
温水浴37℃溶解按
（1）法混匀或12000rpm
离心5分钟，取清液。
4
血清样本稀释
混匀血清
阴性血清40μl加阳性血清
10μl，按
（1）
法混匀。
5倍稀释
5
质控品稀释
混匀质控品
血清稀释液40μl加质控品
法混匀5倍稀释。
6
血清样本
DNA提
DNA提取液完好
血清样本按
（1）法混匀，取30μl加DNA
取
提取液60μl，按
（1）法混匀，98℃8分
钟变性,0℃冷却2-3分钟，12000rpm，
离心10分钟,吸取上清液。
7
质控品DNA变性
分装，有效，呈清液
质控品按
（1）法混匀，取
30μl5000rpm
状态，未反复加热、
离心1分钟，98℃5分钟变性,5000rpm，
冻融
离心1分钟,吸取上清液。
8
PCR反应液
混匀状态
取25μl反应液加5μl提取DNA，按
（1）
法混匀，5000rpm离心1分钟，5000rpm，
9
PCR反应
室温10-30℃
PCR反应槽四角不放管。
10
设阴性对照
阴性混匀血清
CT〉38
11
阳性参考品
各浓度呈梯度
以PCRA反应液制作标准曲线，呈直线。
12
阴性质控品B
以PCRA和B反应液制作标准曲线，呈直
线。
**血清稀释液：
全阴性血清再加2倍HBVDNA提取液混匀,5000rpm，离心1分钟，混匀血清98℃5分钟变性,12000rpm，离心10分钟,吸取上清液。
三.超净工作台的使用、维护保养与清洁标准操作规程
1.目的
建立一个超净工作台的使用、维护保养与清洁标准操作程序，使操作过程标准化。
2.职责
质量部QC负责本文件的起草，质量部及QC检验人员负责本标准的实施。
3.范围
本标准适用于超净工作台的使用、维护和保养与清洁。
4.内容
超净工作台的主要组成部分：
高效过滤器、中效过滤器、通风机、电气控制
及排气管道部分。
安放点的选择：
4.2.1应安放于卫生条件较好的地方，便于清洁，门窗能够密封以避免外界
的污染空气对室内的影响。
4.2.2安放位置应远离有震动及噪音大的地方。
4.2.3严禁安放在产生大尘粒及气流大的地方，以保证操作区空气的正常流
动。
使用前的检查：
4.3.1
接通超净工作台的电源。
4.3.2
旋开风机开关，使风机开始正常运转，这时应检查高效过滤器出风面
是否有风送出。
4.3.3检查照明及紫外设备能否正常运行，如不能正常运行则通知工程部检
修。
4.3.4工作前必须对工作台周围环境及空气进行超净处理，认真进行清洁工
作，并采用紫外线灭菌法进行灭菌处理。
4.3.5净化工作区内严禁存放不必要的物品，以保持洁净气流流动不受干扰。
使用：
4.4.1使用工作台时，先经过清洁液浸泡的纱布擦拭台面，然后用消毒剂擦
拭消毒。
4.4.2接通电源，提前50分钟打开紫外灯照射消毒，处理净化工作区内工
作台表面积累的微生物，30分钟后，关闭紫外灯，开启送风机。
4.4.3工作台面上，不要存放不必要的物品，以保持工作区内的洁净气流不
受干扰。
4.4.4操作结束后，清理工作台面，收集各废弃物，关闭风机及照明开关，
用清洁剂及消毒剂擦拭消毒。
4.4.5最后开启工作台紫外灯，照射消毒30分钟后，关闭紫外灯，切断电
源。
4.4.6每二月用风速计测量一次工作区平均风速，如发现不符合技术标准，
应调节调压器手柄，改变风机输入电压，使工作台处于最佳状况。
4.4.7每月进行一次维护检查，并填写维护记录。
清洁
4.5.1每次使用完毕，立即清洁仪器，悬挂标识，并填写仪器使用记录。
4.5.2取样结束后，先用毛刷刷去洁净工作区的杂物和浮尘。
4.5.3用细软布擦拭工作台表面污迹、污垢目测无清洁剂残留，用清洁布擦
干。
4.5.4要经常用纱布沾上酒精将紫外线杀菌灯表面擦干净,保持表面清洁,
否则会影响杀菌能力.
4.5.5效果评价:
设备内外表面应该光亮整洁，没有污迹。
四.检验方法操作规范
1.混匀：
反应液混匀，按人份量取出，加样，再混匀后5000rpm离心数秒（按原说明进行）。
2.准确：
反应液及样本混匀后,每一步加样准确（按原说明进行）。
3.新鲜血清样本：
血清样本混匀后离心（5000rpm离心数秒），取30μl，加2倍量DNA提取液60μl混匀100℃8--9分钟变性，放置冰箱0℃冷却2-3
分钟,12000rpm离心5分钟，取出全部上清液置另1管混匀，再取5μl加样。
4.长期放置冰箱冷藏血清样本：
取25μl，加无菌水5μl加2倍量DNA提
取液60μl混匀98℃8--9分钟变性，放置冰箱0℃冷却2-3分钟,12000rpm离心5分钟，取出全部上清液置另1管混匀，再取5μl加样.
5.DNA提取液处理并冷藏保存血清样本：
DNA提取液处理：
血清样本混匀，取200μl，加DNA提取液400μl混匀98℃
5分钟变性，放置冰箱0℃冷却2-3分钟,12000rpm离心5分钟，取出全部上清
液置另1管混匀，冷藏保存，按100μl/管分装冷藏保存.
保存血清样本使用：
取1管分装冷藏保存血清样本，融化后混匀，5000rpm离心数秒，再取30-40μl98℃5-6分钟变性，放置冰箱0℃冷却2-3分钟,5000rpm离心数秒，再取5μl加样.
6.质粒DNA有关质控品（P和N）：
用全阴性血清与质粒DNA按9:
1混匀,5000rpm，离心1分钟,再加2倍HBVDNA提取液混匀,5000rpm，离心1分钟，
98℃
分钟变性,12000rpm，离心
10分钟,吸取上清液
取出全部上清
液置另
1管混匀，冷藏保存，按
100μl/
管分装冷藏保存
.
有关质控品使用：
1管分装冷藏保存质控品，融化后混匀，
5000rpm
离
心数秒，再取
30-40μl98
℃
5-6
分钟变性，放置冰箱
0℃冷却
2-3
分钟,5000
rpm离心数秒，再取
5μl
加样.
五.防止荧光定量PCR产物污染的质控规程
规范荧光定量PCR实验和生产的操作过程，确保操作过程中无PCR产物污染。
2.适用范围
本规范适用于荧光定量PCR实验和生产的操作过程。
该规程参照中华人民共和国《艾滋病核酸检测技术规范》。
3.职责划分
操作人员按照此标准操作规范进行荧光定量PCR实验和生产，质检部经理负
责监督。
4.质量保证体系
实验室和生产工作区质控体系
4.1.1实验室和生产工作区原则上应分为四个独立工作区，分别是试剂准备区（GMP车间超净工作室）、样品处理区（质检室1）、扩增区（质检室2）和扩增
产物分析区（质检室3）。
前两区为扩增前区，后两区为扩增后区。
各区的功能
是：
（1）样品处理区：
样品登记、分装。
各种组织匀浆或细胞裂解，进行核酸提取、保存和加样。
（2）试剂准备区：
PCR扩增试剂的配制、分装和保存。
（3）扩增区：
普通PCR扩增及荧光定量PCR扩增。
（4）扩增产物分析区：
PCR扩增产物的电泳、杂交、成像、测定、结果分析、
报告。
4.1.2用有效的方法对操作区域和共用器具在实验前后进行清洁及消毒
推荐的程序是：
a.实验前将次氯酸钠溶液或70%乙醇涂布于操作台或器具表面，两分钟后
用纸巾擦除。
b.移入盛放污染材料的器皿、所需的试剂、耗材和样品，进行试验。
c.一个实验区域在同一时间段只进行一种实验。
d.实验结束后移出个人专用材料至个人专用区域保管；
封好污染材料盛放
器皿并移出至污物袋；
移出共用器具至专门区域保管；
将次氯酸钠溶液或70%乙
醇涂布于操作台或器具表面，两分钟后用纸巾擦除；
打开紫外灯照射至少15分
钟。
4.1.3实验工作区内必须穿好实验工作服，并戴口罩，进行实验操作时根
据要求戴不同规格的手套。
4.1.4PCR产物分析使用相对封闭的系统或共用分析软件时，如特定的凝
胶成像分析检测系统及分析软件或荧光定量PCR仪及分析软件，每位实验人员都
要准确的命名自己的设置程序及分析结果，使用完毕后需收拾好所用的仪器并保
存好自己的实验分析结果。
4.1.5各区域的仪器、设备、器具和试剂应为该区专用，不得交叉使用。
荧光定量PCR扩增实验过程控制体系：
4.2.1样品的采集和处理
4.2.1.
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