基于纳米技术的肺癌早期检测研究Word文件下载.docx

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一、关键科学问题及研究内容

1、拟解决的关键科学问题

本项目围绕肺癌早期检测的重大需求，采用多学科交叉、综合的研究方法，重点解决纳米材料的定向偶联和有序组装机理、低丰度样品富集及微弱信号检测方法以及肺癌早期预警、筛查和检测的新模式等三个方面的关键科学问题：

（1）纳米材料的定向偶联和有序组装机理

为了获得性能良好的生物功能化探针，生物分子在微纳米界面上组装后应该保持原有的生物活性，具有很好的生物相容性，这就需要研究纳米结构与生物分子的定向偶联和有序组装机理。

定向偶联机理问题：

如何实现生物探针在微纳米界面上的定向分布，使生物分子的活性部位背对界面，使其与靶分子结合时空间位阻最小。

有序组装机理问题：

如何实现生物探针在微纳米界面上的均一分布，不重叠，不堆积，呈现为功能化生物分子单层，使探针发挥最佳的靶分子性能。

（2）低丰度生物样本富集及微弱信号检测方法

早期肺癌病人的肿瘤标志物浓度很低，由于检测灵敏度低而出现假阴性。

另外，生物标本（如血清等）中含有大量内源性分子和代谢产物，通常这些物质浓度远高于肿瘤标志物的浓度，是主要的干扰因素，由于标本成份复杂产生干扰而出现假阳性。

本项目将研究肺癌标志物与纳米材料的相互作用机理以及在微流控芯片中的运动特性，设计相应的功能纳米器件，分离标本中干扰组份，保留待测分子及其活性，建立微量肿瘤标志物的高效分离提取富集方法和体系，以达到肿瘤标志物的高灵敏度检测。

（3）肺癌早期预警、筛查和检测的新模式

针对没有适合中国人群的肺癌早期检测敏感性和特异性的问题，联合检测多个肺癌标志物，利用高灵敏、高通量纳米检测技术和生物信息学分析方法，建立肺癌早期检测判别模型，同时提高检测敏感度和特异性，建立与早期肺癌显著相关的血清蛋白和核酸标志物谱，并在高危人群中进行验证，建立适合我国肺癌高危人群患者肺癌预警、筛查和检测的新模式。

2、主要研究内容

围绕肺癌早期检测的重大需求，针对相关的三个关键科学问题展开研究，然后利用临床标本对基于纳米技术的肺癌早期检测新方法进行医学验证，与影像学、痰细胞学方法进行对照研究。

本项目主要开展以下四个方面的研究：

功能纳米材料的制备和表面修饰、纳米探针的设计和构筑、纳米生物器件的研制以及临床验证等研究。

1.1功能纳米材料的制备和表面修饰

功能纳米材料的制备主要包括制备荧光量子点材料，用于构建多种肺癌标志物的同步检测的纳米器件；

包括制备表面等离子体共振金纳米结构和硅纳米线材料，分别用于构建表面等离子体共振传感器和硅纳米线传感器，用于肺癌标志物的超高灵敏检测。

（1）荧光量子点的制备和表面修饰

利用微波辅助水相量子点制备技术，合成出荧光产率高、光稳定性强、粒径分布窄的多种结构II-VI族量子点。

选用适宜的化学或生物材料修饰量子点，使修饰后的量子点既保持原有的光学特性又具有良好的生物相容性。

研究量子点尺寸及表面组成对其物理化学性质特别是光学性质的影响。

（2）表面等离子体共振金纳米结构的制备和表面修饰

研究不同表面等离子体共振金纳米结构如金纳米壳、金纳米星等的制备方法。

研究在SiO2胶体晶膜微球表面金的沉积机理以及金纳米壳层复合结构的制备方法。

研究金纳米壳层结构厚度和表面裂纹以及金纳米星枝角等的控制方法，及其对局域表面等离子体共振光谱（LSPR）及表面增强拉曼光谱（SERS）信号的影响。

（3）硅纳米线的制备和表面修饰

研究光、电、温等影响因素对纳米硅材料的腐蚀作用机理，提高纳米硅材料自停止腐蚀的精度，发展硅纳米线阵列制造的新机理和新方法；

研究掩模、腐蚀、保护等关键工艺的相互制约关系，提高硅纳米线尺寸和表面粗糙度的控制精度，研究不同基团在硅纳米线表面的硅烷化修饰技术。

1.2用于肺癌早期检测的纳米探针的设计和构筑

纳米探针的设计和构筑主要是为了获得有良好生物活性和生物相容性的生物功能化探针，主要包括生物分子在荧光量子点、表面等离子体共振金纳米结构以及硅纳米线表面的定向偶联和有序组装。

（1）量子点与生物分子的偶联和有序组装

研究量子点与具有特异选择或识别功能的生物分子的定向偶联和有序组装；

重点发展针对肿瘤早期检测的具有超灵敏度和特异识别能力的“纳米材料-生物分子”纳米生物复合探针；

研究这些纳米生物探针同待测分子之间的相互作用及其识别能力。

研究量子点与待检测标志物有特异识别的酶、抗体、基因等生物分子的有序自组装（非简单的物理吸附和无序偶联），除利用分子间作用力、静电作用实现量子点与生物分子的自组装外，重点发展基于特定生物分子介导的生物分子有序组装方法，即通过表面功能基团或特定生物分子介导，实现生物分子在量子点表面的定向偶联或有序组装。

研究有效控制量子点的标记数量和标记位置的方法，获得既具有高标记效率又保持高活性的“纳米材料－生物分子”生物复合探针。

研究量子点与不同生物分子的偶联方式，建立一套温和、有效的生物标记方法，在此基础上建立不同功能团的量子点与抗体、酶和DNA等多种生物分子的偶联方法及其纯化方法，并建立相应的规范的操作指南。

（2）生物分子在表面等离子体共振金纳米结构上的可控组装

制备满足生物传感需要的高质量聚苯乙烯有序多孔金纳米结构基底，研究实验条件对其LSPR和SERS性质的影响；

研究在金纳米结构基底的多孔层表面均匀、高效地固定抗体及配基分子的方法，以提高固定效率和固定化抗体及配基分子的稳定性；

利用LSPR位移检测抗原-抗体、配基-生物大分子等的结合过程及结合容量等，得到生物分子相互作用的标准曲线、结合常数及检测灵敏度等，研究非特异性吸附对分析的影响；

利用基于SERS分子独特的振动能级和相应的拉曼指纹图谱检测分子信息，并比较两种检测方法的结果。

（3）生物分子在硅基纳米界面上的可控组装

选择生物识别探针分子（抗体、核酸等），研究其通过不同的自身携带基团或衍生的基团在硅基纳米界面上的定位组装条件；

研究其在界面上的有序性、方向性和三维形态，探索各种不同性质的生物探针在特定环境中的识别行为和捕获行为；

研究通过共组装技术和界面封闭技术减少探针分子与硅基纳米界面之间的非特异性结合，优化硅基纳米生物界面的后处理条件，提高其稳定性和耐受性；

最终获取生物识别探针在一维纳米材料界面上实现可控组装的若干共性条件。

1.3纳米生物器件的研制

首先针对肺癌早期检测，选择适当的联合检测肺癌标志物；

然后构建微流控芯片用于样品中肿瘤标志物的富集，同时消除基质效应；

最后出检测灵敏度高、信噪比、重复性、稳定性和信号均一性等性能良好的纳米生物器件，主要包括基于量子点的纳米生物器件、表面等离子体共振传感器和硅纳米线传感器。

（1）肺癌标志物的选择

根据前期研究结果，综合文献报道，针对肺癌选择癌胚抗原（CEA）、细胞角蛋白21-1片段（CYFRA21-1）、鳞状上皮细胞癌抗原（SCC）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、组织多肽抗原（TPA）、细胞维生素A结合蛋白（RBP），α1-抗胰蛋白酶（α1-AT）、血清铁蛋白（FERRI）以及核酸标志物miRNA（现在已在肺癌患者中检测到的）:

let-7、miR-29、miR-205,miR-99b、miR-203、miR-202、miR-102和miR-2042prec作为早期肺癌联合检测标志物。

（2）微流控分析芯片分离、富集系统的构建

针对临床检验待测样品（血清标本）具有干扰成分多、肺癌标志物含量低等特性。

利用微流控芯片和纳米磁珠，研究实现微量肺癌标志物的有效纯化和富集的方法，主要研究纳米磁珠与肺癌标志物的相互作用，以及微流控技术对结合纳米磁珠的定向富集特性。

设计微流控芯片的各个功能单元，包括样品采集、富集、反应和分离等，同时解决微流控芯片的稳定性和重复性问题，最后可以分离临床标本中干扰组份，保留待测分子及其活性。

（3）基于量子点的多种肺癌标志物联合检测生物器件的构建

为了达到多种肺癌标志物同时检测的目的，拟采用夹心式免疫分析方法同时检测多种肺癌标志物。

将捕获探针与纳米磁珠结合，将信号探针与荧光量子结合，固定有捕获探针的纳米磁珠和固定有信号探针的量子点与待测样品中肺癌标志物夹心结合之后，利用微磁场实现纳米磁珠的定向分离和富集，然后通过检测量子点信号的颜色和强度来确定肺癌标志物的种类和丰度。

光学检测系统基于超光谱成像原理构建，然后通过自主开发的检测分析软件解析出荧光量子点标记种类和待检测肿瘤标志物分子信号强度的对应关系，完成对检测结果的分析。

（4）表面等离子体共振传感器

选择典型的肺癌标志物作为典型的检测体系，研究生物分子等在金纳米结构基底多孔层中的固定以及抗原-抗体等生物分子相互作用，探索利用LSPR和SERS两种互补模式检测样品，在同一基底上实现LSPR与SERS分析技术的组合，建立基于该基底的生物纳米传感检测新方法，用于单个肺癌标志物生物分子的检测。

（5）硅纳米线传感器

选择多种肺癌标志物作为模式靶，研究组装高度有序的功能化硅纳米线捕获元件的方法，研究影响硅纳米线和生物组装效果的关键因素；

研究传感器的可靠性和稳定性封装技术，完成基于硅纳米线的生物传感器组装，用于肺癌标志物（蛋白标志物或核酸标志物）的超高灵敏检测，可检测单个肺癌标志物分子。

1.4临床验证

临床验证主要包括大样本的回顾性研究和前瞻性研究以及生物信息学分析。

（1）回顾性研究

本项目拟开展的临床验证主要利用1500例以上肺癌病人（包括Ia-Ib期，肿瘤直径小于3cm）的血清、组织标本和癌旁标本以及健康对照血样，比较新技术与常规诊断方法对肿瘤标志物检测的吻合度，比较新技术的检出率与低剂量螺旋CT、常规血清肿瘤标志物、痰脱落细胞检测等方法对早期肺癌的检测敏感度和特异性。

通过相关性分析，确定不同病理类型、不同分化程度和不同分期（TNM）的肺癌的特征性mRNA谱，通过ROC曲线分析确定几种标志物联合检测提高肺癌早期诊断的敏感性和特异性，建立肿瘤标志物丰度和肿瘤发病进程的判别模型（确立“正常值范围”），同时利用肿瘤发生前后病人的自身对照血样进行模型修正和校验。

（2）前瞻性研究

利用建立的判别模型，对3000例肿瘤高危人群进行筛查，分别采用新技术和常规诊断方法，如低剂量螺旋CT、痰细胞学和常规血清肿瘤标志物检测对受试人群进行检测，比较新技术与常规诊断方法之间的吻合度。

对于新技术检测阳性的健康人随访24月，观察受试者的预后，比较检测结果与临床预后之间的相关性，以评价新技术用于肺癌早期检测的可行性。

初步推测在3000个高危人群中待随访结束时可确诊肺癌50-60例。

（3）建立在临床标本的生物信息学分析方法

在大量样本的基础上，将肺癌关联标志物随机分群，利用生物信息学分析方法，找到哪些标志物群可以集中体现在某个标志物上，获得最优肺癌早期检测标志物组合，同时具有高敏感性和特异性。

二、预期目标

1、项目总体目标

本项目面向肺癌早期检测的重大需求，研究纳米材料的制备和表面修饰、生物分子偶联、多种肺癌标志物的联合检测以及高灵敏度检测器件的构建，旨在相关基础科学研究上取得突破，获得源头创新。

首先探明纳米材料或纳米结构与具有特异选择或识别功能的生物分子相互作用的机制，达到生物分子的定向偶联和有序组装，在此基础上，研制出用于多种肺癌标志物高灵敏联合检测的纳米量子点生物器件。

同时，研制出基于金纳米结构的局域表面等离子共振和拉曼光谱传感器和硅纳米线传感器，作为量子点生物器件辅助方法，用于肺癌标志物的超高灵敏检测。

通过大样本临床验证，探明肺癌标志物与肿瘤发病进程的关系，纳米生物器件的检测敏感性和特异性均高于85%，最终在肺癌高危人群的早期检测中得到示范应用，从而指导肺癌的早发现、早治疗，提高病人存活率，减小病人经济损失，为人民健康、国民经济建设