CB941700环境和遗传因素导致男性不育与出生缺陷的分子机制资料文档Word文档格式.docx

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中国科学院

一、研究内容

拟解决的关键科学问题

精子异常是男性不育和父源性出生缺陷发生的主要原因。

阐明环境EDCs、遗传因子改变致精子异常的分子机制和机体对EDCs易感性差异的分子基础，揭示男性不育和出生缺陷的复杂病因及其发病机制是本项研究的关键科学问题。

其中包括：

1.代表性EDCs通过何种分子机制影响下丘脑-垂体-睾丸轴以及精子发生、成熟过程的不同环节，从而引起精子异常的各类表型？

2.遗传因子如染色体重组交换和联会改变引起精子发生停滞或染色体异常的分子机制和调控机理是什么？

3.环境-基因交互作用导致男性不育的作用模式和机制是什么？

4.精子异常导致常见出生缺陷如染色体病和先天性心脏病发生的机制是什么？

主要研究内容

1．环境因素导致精子异常的分子机制

1.1代表性EDCs的代谢特征及其与精子异常的关系

通过体内和体外研究代表性EDCs的代谢特征，阐明EDCs内暴露与精子异常的关联，寻找接触性生物标志物。

从我国目前环境污染的现状出发，并结合项目组多年的研究基础，遵循“有所为、有所不为”的原则，拟选择邻苯二甲酸酯类、烷基酚类/双酚系化合物、农药杀虫剂类、多环芳烃类、多溴联苯醚类、全氟代烃类和重金属类共七类为目标EDCs。

首先通过体外代谢特征和内分泌干扰活性分析并结合动物染毒模型，初步筛选出关键的EDCs因子；

然后围绕这些关键EDCs，收集男性不育（精子异常）和职业暴露人群和正常男性对照病例，采集流行病学信息和精液、血液、尿液生物样本，分析EDCs内暴露水平和男性生殖内分泌功能，评价EDCs及其代谢与男性不育（精子异常）的相关性。

运用动物染毒模型结合基因芯片技术筛选与EDCs有关的代谢酶基因，利用酶反应学、细胞生物学和质谱分析技术，鉴定代表性EDCs的关键代谢酶、代谢特征，初步确定候选代谢产物。

利用受体报告基因系统，甄别候选代谢产物的雌激素/抗雌激素、雄激素/抗雄激素、甲状腺激素/抗甲状腺激素活性，初步明确代表性EDCs代谢产物的内分泌干扰活性。

运用动物模型研究代表性EDCs候选代谢产物与精子异常的关系，初步确认相关EDCs特征性代谢产物；

应用高效液相

色谱等方法，分析病例和对照人群生物样本中EDCs的代谢产物水平及与男性精子异常的相关性，筛选出代表性EDCs的接触性生物标志物。

运用代谢组学的研究思路，应用UPLC-Q-TOF等方法针对精子异常不同表型和对照的生物样本进行代谢产物谱分析，结合主成分分析等数据分析平台进行分析，进一步验证和确定上述生物标志物。

1.2代表性EDCs致精子发生异常的分子靶标

通过系统研究代表性EDCs对下丘脑-垂体-睾丸轴以及精子发生、成熟过程不同环节的影响，初步阐明代表性EDCs对雄性生殖损害的靶点和分子途径。

采用针对不同发育阶段小鼠下丘脑-垂体-睾丸轴定点染毒的方法，观察染毒位点下游靶细胞的变化，分析相应激素的分泌和相关基因的表达，确定EDCs损伤下丘脑-垂体-睾丸轴的作用位点。

重点关注代表性EDCs通过下丘脑-垂体-睾丸轴影响精子发生的微环境激素调控作用及方式，特别是支持细胞、间质细胞对精子细胞的影响及它们的相互作用。

运用基因组学、蛋白组学、miRNA基因芯片技术构建正常小鼠和染毒小鼠精子发生不同阶段睾丸基因、蛋白质和miRNA表达谱，通过比对获得差异表达基因、蛋白质和miRNA，作为EDCs导致精子发生障碍的侯选作用靶分子，对部分差异基因、蛋白质和miRNA进行功能研究，阐明EDCs的作用机制。

同时，采用生物信息学技术对所获得差异表达基因及其编码蛋白进行整合分析，发现EDCs导致精子发生障碍的新的作用通路，试图找到关键性的分子标记物。

然后，运用RNA干扰和基因敲除技术，建立标志性分子的缺陷小鼠动物模型和细胞模型，验证上述标志性分子对精子发生的影响。

2．遗传因素导致精子异常的调控机理

2.1减数分裂重组交换异常致精子发生异常的分子机制

MLH1是重组交换过程中的关键蛋白，研究MLH1在精子发生中的确切作用和分子机制，以阐明重组交换异常导致不育和非整倍体形成的分子机理，为不育的个性化诊断提供新的依据。

分别获取人类正常、无精、有染色体分离错误的严重寡精症患者的睾丸活检组织，运用免疫荧光细胞遗传学等方法对MLH1的数目、位置及调控（如位点干涉）、重组交换相关的重要事件（如同源染色体配对、联会）和减数分裂停滞、染色体分离错误之间的关系进行关联度的研究。

并同时探讨影响MLH1分布的因素如年龄、甲基化、miRNA、染色体端粒（长度和端粒酶活性）等。

运用免疫荧光细胞遗传学研究已知的重组交换相关蛋白（如RAD51/DMC1等）的时空表达模式和与MLH1共定位情况。

运用酵母双杂交或免疫共沉淀筛选出与MLH1结合的未知蛋白。

然后综合运用活细胞实时摄影、荧光共振能量转移技术、免疫共沉淀或酵母双杂交等研究MLH1与这些已知/未知的重组交换蛋白之间的相互作用，确定这些蛋白相互作用的改变对精子生成的影响及其分子机制。

在此基础上找出关键的染色体重组交换相关的蛋白，然后运用基因敲除、RNA干扰或转基因小鼠动物模型来验证这些基因的功能和对精子发生的影响及作用的分子机制。

运用基因芯片分析具有染色体分离错误的睾丸基因表达方案，与正常睾丸基因表达方案比较，找出差异表达显著的基因，结合生物信息学方法对差异表达显著的基因进行染色体定位，然后对这些基因再用实时定量RT-PCR来确认。

运用基因敲除、RNA干扰或转基因小鼠动物模型来验证这些基因的功能，并根据这些基因的功能进一步分析重组交换异常导致染色体分离错误、非整倍体形成的分子机制。

利用RNAi、凝胶迁移或电泳迁移率检测技术、免疫共沉淀、染色质免疫共沉淀和已建立的小鼠动物模型研究类固醇激素调节重组交换、染色体分离关键基因表达、转录的分子机理，以探讨影响重组交换、精子发生的因素和机制。

2.2减数分裂联会缺陷致精子发生异常的分子机制

同源染色体之间的联会缺陷可引起减数分裂进程阻滞，配子发生障碍，导致无精症的发生，但联会缺陷引发无精症确切的机制尚不清楚。

分别获取正常及不育的人类睾丸组织，运用免疫荧光细胞遗传学方法，鉴定不育患者减数分裂前期的不同时期，减数分裂停滞的时期；

定位不联会区域发生在哪些常染色体上；

确定不联会区域出现的频率，其与性染色体在减数分裂时期的关联，基因沉默相关蛋白γH2AX等、RNAi途径相关蛋白如MIWI等在不联会区域和性染色体上的表达情况，鉴定性染色体和不联会区域是否发生了基因沉默及miRNA在联会异常中的功能和作用机制。

运用流式细胞仪和免疫荧光技术筛选出减数分裂前期各亚期细胞，通过基因芯片分析全面了解这些时期细胞差异表达的基因，结合生物信息学方法对差异表达显著的基因进行染色体定位，确定性染色体和含不联会区域的常染色体上分别有哪些基因发生改变；

对这些基因再用实时定量RT-PCR来确认，并根据这些基因的功能进一步分析联会缺陷导致减数分裂停滞的机制。

运用miRNA基因芯片技术构建正常及不育的人类睾丸组织miRNA表达谱，通过比对获得差异表达miRNA，来研究其对联会异常相关基因的调控和对精子发生的影响。

3．环境-基因交互作用与男性不育

结合上述代表性EDCs所致效应的分子机制以及遗传机制的研究结果，采用非参数回归分析的方法研究个体易感性与EDCs交互作用致男性不育的模式和强度，有机整合各类标志物，建立EDCs危险度评价模式，为高危人群筛检提供依据。

再以模式动物为基础，验证环境-基因交互作用，并深入阐述其作用机理。

3.1男性不育基因组高通量遗传多态性筛检

选择精子发生、EDCs代谢、DNA损伤修复、细胞凋亡、生殖激素调控相关基因，同时选择内容一和内容二发现的EDCs导致精子异常的可能靶基因或信号通路，综合运用“以序列为基础”和“连锁不平衡图谱法为基础”的SNPs选择策略，对100个左右的基因1500个位点进行高通量的基因多态性研究，寻找EDCs导致男性不育个体差异的易感基因，并揭示其分子机制。

3.2男性不育人群表观遗传靶点的鉴别

在男性不育基因组高通量遗传多态性筛检的基础上，结合动物模型的表观遗传研究，选择阳性关联的基因，研究其组蛋白乙酰化水平和精子基因组CpG岛甲基化模式与男性不育症的关系，揭示男性不育人群的表观遗传基础及其在个体对于EDCs易感性差异中所起的作用。

3.3环境-基因交互作用致男性不育的分子机理研究

首先结合男性不育遗传和表观遗传易感性标志物，采用非参数回归分析的方法考察其与EDCs交互作用致男性不育的模式和强度，在此基础上有机整合各类标志物和可用于筛检的分子靶标，利用生物统计学和生物信息学方法，初步建立EDCs危险度评价模式，作为筛检高危人群的依据。

然后以模式动物为基础，采取析因设计方法，针对产生交互作用的环境和遗传/表观遗传因素进行分组，验证该环境-基因交互作用，并深入探讨具体的作用机理和作用靶标。

4．精子异常与常见出生缺陷

染色体病和先天性心脏病是最常见的出生缺陷，两者发病率的总和占据了总出生缺陷近1/4。

本课题以Y染色体数目或结构异常为染色体病的代表，以心脏圆锥动脉干畸形为先天性心脏病的代表，探讨常见出生缺陷发病的父源性原因。

4.1父源性出生缺陷相关致病基因的筛选

应用比较基因组杂交和生物芯片相结合的新型arrayCGH技术，辅助以基因组扫描、差异甲基化杂交和基因测序等方法，分析大样本常见染色体疾病和先天性心脏病患儿父亲的精子、血液和患儿血液白细胞中的DNA序列。

特别关注异常序列或异常修饰位点在父子DNA间是否相同。

对于父子间相同的异常DNA信息，进行生物信息学和生物统计学分析，最终确定这些异常的位点是否为常见染色体病或先天性心脏病的致病候选基因或致病基因。

4.2致病基因在出生缺陷发生中的作用及机理

将筛选出的染色体病或先天性心脏病致病候选基因单个或联合在神经干细胞和心肌干细胞中上调、下调或敲除，观察它们对干细胞分化和细胞功能的影响。

然后应用基因打靶和转基因技术，在精子或受精卵水平对上述发现的疾病候选基因分别或组合上调、下调或敲除，观察胚胎发育过程的变化及出生缺陷的发生情况。

特别关注本课题组及他人在前期研究中发现的8个先天性心脏病可能的候选致病基因的功能，它们是转化生长因子β2（TGFβ2）、维甲酸核内受体（RXRα）、Vangl2、细胞缝隙连接蛋白43（Cx43）、Pax3、内皮素-1（ET-1）及其转化酶和HIRA。

二、预期目标

总体目标：

通过本项目的完成，建立国际一流的研究男性生殖健康的现代技术平台，在初步阐明代表性EDCs与遗传因子交互作用引起精子异常，从而导致男性不育和出生缺陷的分子机制的基础上，提出以机体对EDCs的应答为基础、以早期生殖损害为核心、以生物标志物为目标的“导向预防”新理论，为建立男性不育个性化诊断和筛查出生缺陷人群的新方法提供理论依据。

同时造就出一支具有国际影响力、学科交叉性强、能够独立从事科学研究的创新人才队伍。

5年预期目标：

具体考核指标如下：

1.阐明代表性EDCs致精子异常，在分子、细胞、器官和系统多层面上的作用靶标和分子机制，发现与精子异常相关的接触、效应和易感生物标志物。

2.揭示遗传因子如减数分裂重组交换和联会改变导致男性不育和出生缺陷的分子机制，并找出其影响因素。

3.建立个体遗传/表观遗传背景与EDCs暴露交互作用致男性不育的危险度评价模式和强度，了解交互作用致男性不育的分子机理。

4.明确精子异常与染色体病和先天性心脏病之间的关系,认识父源性出生缺陷的病因。

5.发表SCI论文60-70篇，其中影响因子>

5的论文8-10篇；

培养硕士和博士研究生60-80名，博士后6-1