整理β葡萄糖苷酶的分离纯化文档格式.docx
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Sigma公司
对硝基酚（NPG）
DEAE-SepharoseFastFlow
Amersham公司
Sephacry1S-200
蛋白胨
北京奥博星生物技术有限责任公司
硫酸铵
上海实验试剂有限公司
过硫酸按
Fluka公司
考马斯亮蓝R-250，G-250
北京鼎国生物技术发展中心
丙烯酞胺、甲叉双丙烯酞胺
中国医药（集团）上海化学试剂公司
TEMED
PMSF
SDS
Tris
上海伯奥生物科技有限公司
甘氨酸
甲硫氨酸
低分子量标准蛋白
天根生化科技（北京）有限公司
PEG-20000
天津市科密欧实验化学试剂开发中心
快速银染试剂盒
碧云天生物技术研究所
芦丁（≥95％）
国药集团化学试剂有限公司
槐角苷（90％）
实验室自制
槐角提取物（10：
1）
西安天园生物技术有限公司
4.1.1.4仪器
TG-332A微量分析天平
上海天平仪器厂
低速大容量离心机
上海精密仪器仪表有限公司
电泳仪（DYY-Ш型）
北京六一仪器厂
UV2000紫外-可见光分光光度计
尤尼柯（上海）仪器有限公司
4.1.2方法
4.1.2.1粗酶液的获得方法
将菌种DS1接种到PDA斜面活化3d后，挑取一定大小的菌块接入PDY培养基中，培养3d制备一级液体种，再以10％的接种量接入PDY培养基中培养3d制备二级液体种。
按10%的接种量将二级种加入含有100mL发酵培养基中，于27℃，150r/min摇床上培养。
每天取一瓶发酵液在4000r/min条件下离心10min后，取上清液在标准条件下用pNPG测定β-葡萄糖苷酶的活性。
如此持续取三角瓶内的培养液直至培养的第10d为止，取β-葡萄糖苷酶的活性最高的培养液为粗酶液。
4.1.2.3对硝基酚标准曲线的绘制
见方法2.1.2.2。
4.1.2.4β-葡萄糖苷酶酶活测定
对硝基酚-β-葡萄糖苷（pNPG）法[54]测定β-葡萄糖苷酶酶活。
4.1.2.5蛋白质含量的测定
考马斯亮蓝G250法。
将测试酶液稀释到一定浓度，取0.5mL于试管中再加入2.5mL考马斯亮蓝G250试剂，摇匀，静置10min后，在595nm条件下进行蛋白质含量测定。
以牛血清蛋白做标准曲线为Y=4.905X-0.0131，R2=0.9928（Y为吸光值，X蛋白质含量）。
4.1.2.6硫酸铵分级沉淀、脱盐和浓缩
1.确定盐析时饱和度范围
（1）取粗酶液7份，每份15mL;
（2）分别用饱和度为20％-80%相对饱和度的（NH4）2SO4于4℃盐析12h;
（3）以不加硫酸铵的酶液为对照，于冰箱中于4℃盐析12h；
（4）8500r/min于4℃离心20min;
（5）分别收集各离心管中的上清液和沉淀，并用pH5.0的乙酸-乙酸钠恢复至原体积，在A595与A410条件下分别测定其蛋白质含量和β-葡萄糖苷酶活力。
2.最佳pH条件下盐析
（1）在100ml粗酶液中缓慢加入硫酸铵至X1%饱和度；
（2）4℃静置12h;
（3）4℃，8500r/min条件下离心20min，取上清液，测量上清液体积；
（4）在上清液中继续缓慢加硫酸铵至X2%饱和度；
（5）4℃静置12h;
（6）4℃,8500r/min条件下离心20min，取上清液，沉淀溶于最佳pH值的乙酸-乙酸钠中。
并在相同的缓冲溶液中透析过夜，直至检测不出SO42+为止,4500r/min离心15min，取上清。
4.1.2.7DEAE-SepharoseF.F.阴离子交换柱层析
将收集的上清液施于经Tris-HCL缓冲液（pH=8.10,50mmolTris-HCL缓冲溶液）预平衡的DEAE-SepharoseF.F.层析柱上（1.0cmx20cm），酶蛋白先用约5倍柱体积的缓冲液洗脱至A595不变后，再用300mLpH=8.10,50mmol和300mL含1mol/LNaCl的相同缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为1.2mL/min，5min收集1管。
将每管在标准条件下进行活性测定，收集β-葡萄糖苷酶酶活性较高的洗脱液。
4.1.2.8Sephacry1S-200凝胶过滤层析
将上步所收集的酶液用聚乙二醇（PEG）包埋法将酶液浓缩至2mL，进行Sephacry1S-200凝胶过滤层析（1.6cmx76cm），用pH=8.10,50mmolTris-HCI缓冲液洗脱，流速为0.4mL/min，5min收集1管。
进行活性测定后收集具有酶活性的洗脱液部分，对其进行SDS-PAGE（SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳）确认纯度。
4.1.2.9SDS-PAGE电泳溶液及胶的配制
表4.1SDS-PAGE电泳溶液及胶的配制
名称
配制方法
保存条件
A液
丙烯酰胺3.00g
凝胶浓度30%,交联度2.67%
双丙烯酰胺0.08g
4℃
加双蒸水定容至5.0mL
B液
1.5MpH=8.8Tris-HCl缓冲溶液
（分离胶缓冲溶液）
Tris18.2g
1MHCl调节pH至8.8
双蒸水定容至100mL
C液
0.5MpH=6.8Tris-HCl缓冲溶液
（浓缩胶缓冲溶液）
Tris1.8g
1MHCl调节pH至6.8
双蒸水定容至30mL
聚合起始剂
10%过硫酸铵
室温,现配现用
0.5g过硫酸铵,加5mL双蒸水溶解
聚合促进剂
电泳缓冲液
Tris9.0g
规划环境影响评价技术导则由国务院环境保护主管部门会同国务院有关部门制定；
规划环境影响评价技术规范由国务院有关部门根据规划环境影响评价技术导则制定，并抄送国务院环境保护主管部门备案。
甘氨酸43.2g
1.建设项目环境影响报告书的内容
SDS3g
C.环境影响报告书
（3）机会成本法
（二）建设项目环境影响评价的工作等级加双蒸水至600mL
2）预防或者减轻不良环境影响的对策和措施。
主要包括预防或者减轻不良环境影响的政策、管理或者技术等措施。
样品溶解液
0.5MpH=6.8Tris-HCl3.0mL
3.意愿调查评估法
环境影响经济损益分析一般按以下四个步骤进行：
甘油2.4mL
（1）规划和建设项目环境影响评价。
SDS0.48g
β-巯基乙醇1.2mL
0.5%（W/V）溴酚蓝1.2ml
发现规划存在重大环境问题的，审查时应当提出不予通过环境影响报告书的意见；
共计8.0mL
染色液
考马四亮蓝R-2500.125g
室温
甲醇113.5mL
冰乙酸23mL
加去离子水至250ml
脱色液
甲醇25mL
冰乙酸37.5mL
加去离子水至500mL
表4.2分离胶和浓缩胶的配制
胶溶液
分离胶（8%）
浓缩胶（5%）
5.3mL
1.7mL
7.6mL
/
1.25mL
10（W/V）SDS
0.2mL
0.1mL
聚合起始液
12μL
10mL
双蒸水
6.7mL
6.8mL
共计
20mL
4.1.2.10电泳具体操作步骤
（l）将配制好的8%的分离胶溶液混合均匀，然后将凝胶溶液迅速倾入制胶玻璃板中，至胶液面距玻璃板凹槽3cm左右，然后在胶面上轻轻铺注1cm高的水层，垂直放置胶板，待胶凝聚后，用滤纸轻轻吸出胶面上的水，注意不要破坏胶面。
（2）将配制好的5%浓缩胶迅速注入到分离胶的上层，至液面与玻璃板的凹槽平齐，插入梳子后，在室温下放置20-30min，待其完全凝聚后，小心拔出梳子并倒入电极缓冲液。
（3）将蛋白样品加入等体积的样品缓冲液，混匀后在沸水中煮3-5min，冷却后用微量进样器将其加入上样孔中。
（4）将电泳槽与电泳仪相连，保持150V的恒定电压进行电泳，直至样品中染料迁移接近至下端时关闭电压，停止电泳。
4.1.2.11蛋白质的染色及脱色
1.固定：
电泳结束后，取凝胶放入约100mL固定液中，在摇床上室温摇动20min，摇动速度为60-70r/min。
固定40min以上甚至过夜可以进一步降低背景。
固定液的配制：
依次加入50mL乙醇、10mL乙酸和40mLMilliQ级纯水或双蒸水，混匀后即成100mL固定液。
2.30%乙醇洗涤：
弃固定液，加入100mL30%乙醇，在摇床上室温摇动10min，摇动速度为60-70r/min。
30%乙醇的配制：
70mLMilliQ级纯水或双蒸水中加入30mL乙醇，混匀后即成100mL30%乙醇。
3.水洗涤：
弃30%乙醇，加入200mLMilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动10min，摇动速度为60-70r/min。
4.增敏：
弃水，加入100mL银染增敏液（1X），在摇床上室温摇动2min，摇动速度为60-70r/min。
银染增敏液（1X）的配制：
99mLMilliQ级纯水或双蒸水中加入1mL银染增敏液（100X），混匀后即为银染增敏液（1X）。
银染增敏液（1X）配制后需在2h内使用。
5.水洗涤（共2次）：
弃原有溶液，加入200mLMilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1min，摇动速度为60-70r/min。
弃水，再加入200mLMilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1min，摇动速度为60-70r/min。
6.银染：
弃水，加入100mL银溶液（1X），在摇床上室温摇动10min，摇动速度为60-70r/min。
银溶液（1X）的配制：
99mLMilliQ级纯水或双蒸水中加入1mL银溶液（100X），混匀后即为银溶液（1X）。
银溶液（1X）配制后需在2h内使用。
7.水洗涤：
弃原有溶液，加入100mL
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