超滤法提取纳豆激酶的技术参数优化解析Word下载.docx

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采用超滤技术对纳豆激酶进行分离提纯，可提高酶活性及回收率，技术参数可行。

关键词：

纳豆激酶；

超滤；

比活力；

纯化倍数；

回收率

中图分类号：

TQ925文献标志码：

A文章编号：

1005-9989（2010）05-0225-05

Studyontechnologyforextractingnattokinasebyultrafiltration

CHENJing-xin,LIUYan-yan,SHAWei,ZHANGLi-ping*

（TheFoodScienceofHeilongjiangBayiAgriculturalUniversitiy,Daqing163319）

Abstract:

Objective：

Studyedtheimpactofmembranefluxonutrafiltrationsystempressure,ultrafiltrationtemperatureandpH,determinedtheoptimumconditionsofnattokinaseseparation.Methods:

therawmaterialswaspreparedfromcrudenattokinaseliquid,byultrafiltrationandchromatographydeterminedthespecificactivity,purificationmultiplesandrecoveryrate.Results:

Theoptimizedconditionswereasfollowing:

reactionpressure0.25MPa,liquidtemperature37℃,liquidpH7,thespecificactivity9610.46IU/mg,thepurificationmultiple2.36andtherecoveryrate92.3%,thepurifiedenzymewasdemonstratedbySDS-PAGEtobeahomogeneousprotein,molecularmasswasabout28000u.Conclusion:

Itisfeasibletoseparateandpurifynattokinasebyusingultrafiltrationtechnology,anditcanelevateactivityandtherecoveryrate.

Keywords:

nattokinase;

ultrafiltration;

enzymeactivity;

purificationmultiple;

recovery

纳豆激酶（NK）是纳豆在发酵过程中由纳豆菌产增的具有潜在药用价值的物质。

生的一种丝氨酸蛋白酶，可水解纤维蛋白成小肽近年来国内外纳豆激酶分离纯化的相关研究和氨基酸，和蚯蚓纤溶酶、蛇毒纤溶酶一样可直很多，主要有层析法、磁性微球分离法、集成化接溶解血栓[1]。

研究表明，纳豆激酶是一种溶栓效分离技术，包括双水相亲和分配技术、扩张床吸果十分显著，并且能够预防和抑制血栓产生与扩附技术、混合模式扩张床吸附技术等。

以上分离收稿日期：

2009-08-31*通讯作者

基金项目：

黑龙江省农垦总局课题（HNKXIV-06-05a）。

作者简介：

陈景鑫（1982—），女，硕士研究生，研究方向为食品科学。

·

225·

提取物与应用

FOODSCIENCEANDTECHNOLOGY

期

方法虽然工艺简单，实验条件容易控制，在纳豆激酶分离纯化中得到了广泛应用，但至今都停留在实验室研究阶段，而且总产率较低，多为间歇操作，生产效率难以提高，从而造成纳豆激酶分离纯化的成本很高，难以实现工业化生产[2]。

超滤是以压差为驱动力的膜分离技术。

按照截留分子量的大小，可分离300～1000ku的大分子物质。

比膜孔小的物质和溶剂一起透过膜，而较大的物质则被截留[3]。

李立民等[4]通过加入CaCl2和Na2CO3对发酵液进行盐析处理、离心过滤、超滤浓缩、离子交换层析等操作之后，得到了较纯的酶，活力为3528IU/mg，酶回收率为61.74%。

但是，结果表明，该方法中的盐析处理降低了酶的活力；

另一方面，其利用的超滤只是进行了浓缩，并未达到分离的目的。

由于超滤技术在操作过程中无相变化，因此不会改变产品的性能和活性，是一个简单的过程。

超滤设备和工艺较其他分离方法简单，耗能低，滤膜可以反复多次使用；

处理量大，处理时间短，样品残留小，产品收率高[3]。

因此，本研究将液体深层发酵后的纳豆激酶经过滤、离心处理后，拟直接采用超滤技术对其进行提取，达到分离纯化的目的。

但是超滤膜在使用过程中的一个主要问题是由于浓差极化、膜孔堵塞及凝胶层出现等因素的影响，导致膜通量随运行时间的延长而降低，因此本实验重点研究超滤系统的操作压力、料液温度、料液pH值对膜通量的影响，使超滤系统能高效稳定运行，提高产品得率。

11.1

材料与方法材料

发酵第2天产生的发酵液以4000r/min、20min离心分离，得到上清液，再将得到的上清液进行抽滤，可得到滤液。

抽滤的目的是防止杂质堵塞滤膜。

1.3.2

纳豆激酶的膜分离方法

将抽滤后得到的

纳豆激酶液通过截留分子量为30000u的超滤膜，再将其透过液通过截留分子量为10000u的超滤膜，收集中间分子量段的纳豆激酶滤液。

分别采用不同的操作压力、不同料液温度、不同料液pH进行超滤，考察其对超滤膜膜通量的影响并进行方差分析，以确定最佳技术参数。

1.3.3

膜通量的测定

超滤系统运行稳定后，按

试验设计控制压力、料液温度、料液pH等操作参数,，取样，记录一定时间内的透过液，重复3次求平均值,，按下式计算膜通量。

J=V/T×

A

式中：

J为膜通量，L/m2·

h；

V为取样体积，L；

T为取样时间，h；

1.3.4

A为有效膜面积。

纳豆激酶层析分离为了得到单一分子量

的纳豆激酶，将超滤分离后的酶液进行进一步的层析分离，分别考察纳豆激酶在SephadexG-75、SephadexG-50和HPD-400中的分离效果，通过活性测定及分离效果分析，最终确定采用HPD-400做为层析分离的填料。

其操作步骤如下：

（1）树脂的预处理：

称取一定量的树脂，加质量分数为2%的NaOH浸泡过夜，用蒸馏水洗至中性，再加体积分数为95%乙醇浸泡2h，然后用蒸馏水洗至乙醇完全除尽，置于50℃恒温烘箱中烘干备用。

（2）装柱：

用玻璃棒搅拌均匀后引流灌入内径1.6cm的柱子中，让树脂自然沉积，打开出水口，待树脂自然沉积完毕后，关闭出水口。

灌好后的柱子应表面平整，柱体无气泡，以免影响分离。

（3）平衡：

灌好的柱子胶面上用洗脱液加满直至进样口，并确保没有气泡进入，然后进行2～5柱床体积平衡。

（4）上样：

等洗脱液液面距离胶面2mm时将样液延柱壁缓慢加入，防止加样时将胶面冲起影响分离，上样量1mL。

（5）洗脱：

上样后待样液进入柱床，并与柱床基本平齐时加入40%体积浓度的乙醇溶液进行洗脱。

纳豆激酶发酵液：

由实验室纳豆菌发酵制得；

凝血酶：

中国药品生物制品检定所；

纤维蛋白原：

北京奥博星生物技术责任有限公司；

尿激酶：

琼脂糖：

台湾MDbio公司；

考马斯亮蓝：

sigma公司；

其他试剂：

分析纯。

1.2

仪器

切向超滤装置：

PN33349，PALL；

超滤泵：

7518-00，MASTERFLEX；

层析柱：

Ф1.6×

50cm，上海精科实业有限公司；

紫外可见分光光度计-T6新世纪：

北京普析通用仪器有限责任公司；

台式离心机：

北京京立离心机有限公司；

SHB-3循环水多用真空泵：

郑州杜甫仪器厂。

1.3方法

1.3.1纳豆激酶粗酶液的制备将经过深层液体

226

（6）收集：

以0.8mL/min的速度进行洗脱，分部响的差异显著性及各因素水平之间的差异显著性。

收集，每管收集2mL并对其进行活性及纳豆激酶

含量测定。

2结果与分析

1.3.5纳豆激酶活性的测定纳豆激酶纤溶活力2.1不同操作压力下纳豆激酶料液的膜通量的测定采用纤维蛋白平板法，即依照Astrup[6]等报准确称取处理后的酶液，将超滤压力分别设道的纤维蛋白平板法，测定方法如下：

将琼脂糖、定在0.1、0.15、0.2、0.25、0.3MPa，试验设置5个血纤维蛋白原（Fibrinogen）溶液和凝血酶溶液按一定水平（n=5），超滤温度根据一般蛋白质的超滤数据比例混合，制成人工血栓平板。

取纳豆激酶样品设为37℃，超滤过程中料液pH7，测定膜通量及点样于平板上，37℃恒温孵育，测溶解圈直径，纳豆激酶含量，实验结果见表1。

根据所得数据绘并以尿激酶作标准品对照绘制标准曲线，以测得制出超滤压力与膜通量及纳豆激酶含量的关系曲纤维蛋白溶解圈面积来表示纳豆激酶的活性。

线图，见图1。

1.3.6纳豆激酶含量的测定纳豆激酶含量的测602.5定采用考马斯亮蓝法（Braford）[7-8]，方法如下：

取一50

定量的纳豆激酶样品，用0.15moL/LNaCl配成1002.0

）

40）L

2·

h

mL样品溶液。

取4支试管，其中一支加入0.15moL/mm

/

L1.5g

（m

/（

LNaCl溶液1mL（空白对照），另3支中加入样品1量30/

通量

mL，然后每支试管加入5mL考马斯亮蓝试剂，立膜20含

膜通量1.0KN

即混匀，1h内以1号管为空白对照，在波长595nm10NH含量0.5处比色，并通过标准曲线确定纳豆激酶含量。

1.3.7数据统计分析方法通过超滤单因素实验，0.10.150.20.250.30

压力/MPa

确定超滤压力、料液温度、料液pH对膜通量的影图1不同操作压力对膜通量的影响响，采用SAS8.2软件系统，分析各因素对膜通量影在表1超滤压力的因素分析中，F值为276.87，

表1超滤压力的方差分析及多重比较

压力y1y2y3平均值变异来源SSdfMSF值Pr＞F5%水平0.2552.551.153.052.2处理间1151.484287.87276.98＜0.0001A0.349.548.250.049.2处理内10.393101.0393B0.246.545.047.346.3总变异1161.8814C0.1538.037.039.038.0D0.128.029.027.028.0EP值＜0.0001，R=0.9911，说明超滤压力对膜通量的量下运行，提高膜分离效率，减少膜污染，确定变化有显著差异，且压力各水平之间也存在显著最佳操作压力为0.25MPa。

性差异；

由图1可以看出，膜通量随着操作压力的2.2不同料液温度下纳豆激酶料液的膜通量

增加先增加后下降，在直线上升阶段，随着压力准确称取处理后的酶液，将超滤温度分别设的增大，膜两侧压差增加，膜通量呈直线迅速上定在20、25、35、40、45℃5个水平（n=5），超滤升，此时膜通量较小，