米非司酮诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡机制的研究Word文档下载推荐.docx

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随着米非司酮浓度的增加，Hela细胞中NF-κBp65蛋白表达水平逐渐下降。

结论米非司酮可能通过NF-κB信号通路下调NF-κBp65蛋白表达，从而调节细胞周期，诱导Hela细胞凋亡。

【关键词】人宫颈癌；

Hela细胞株；

米非司酮；

凋亡；

细胞周期；

NF-κB；

p65

　　Abstract:

ObjectiveToinvestigatetheregulatoryeffectofmifepristoneonthecellapoptosisofhumancervicalcancercelllineHelaandtheunderlyingmechanisms.MethodsHumancervicalcancercelllineHelawasculturedinvitro.Flowcytometryanalysistechniquewasusedtodeterminethechangesofcellcycledistributionandcellapoptosispercentageaftertreatmentwithdifferentconcentrationsofmifepristone.WesternblotwasperformedtoexaminetheeffectofmifepristoneontheexpressionofNF-κBp65proteinofHelacellline.Results5,10and20μmol/LmifepristonesignificantlyincreasedthecellapoptosispercentageandtheproportionofcellsinG0/G1phaseofHelacellsanddecreasedtheproportionofcellsinSandG2/Mphasesinadose-dependingmanner.Withtheincreaseofmifepristoneconcentrations,theexpressionofNF-κBp65wasgraduallydownregulatedinHelacells.ConclusionMifepristonecanregulatecellcycledistributionandacceleratecellapoptosisbydownregulatingtheexpressionofNF-κBp65proteinincelllineHelaviaNF-κBsignalingpathway.

　　Keywords:

humancervicalcancer;

celllineHela;

mifepristone;

apoptosis;

cellcycle;

NF-κB;

p65

　　米非司酮（mifepristone,MIF）是人工合成的抗孕激素药物，目前在临床上主要用于终止早孕、引产等。

近年研究发现，米非司酮还具有抗肿瘤、增强抗癌药物疗效等其他临床新用途。

核因子－κB（nuclearfactorofkappabinding,NF-κB）是一种具有多向调节功能的核转录因子，参与细胞的增殖、凋亡和癌基因的转录调控的信号传递过程，并被证实和宫颈癌的发生发展密切相关［1-2］，NF-κBp65则是NF-κB在体内发挥生理功能的主要亚单位之一。

本实验的目的是研究不同浓度的米非司酮对人宫颈癌Hela细胞生长及对NF-κBp65蛋白表达的影响，探讨米非司酮对宫颈癌的治疗作用及其可能的作用机制，为宫颈癌的防治寻找新途径。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　人宫颈癌Hela细胞株（中国医学科学院血液学研究所惠赠），米非司酮纯粉剂（浙江仙琚制药股份有限公司惠赠），DMEM干粉（美国Gibco公司），碘化丙啶（PI）、MTT（美国Amersco公司），NF-κBp65抗体（碧云天生物技术研究所）。

　　1.2方法

　　1.2.1细胞培养

　　常规复苏冻存的人宫颈癌Hela细胞，接种于盛有DMEM培养液（含10%胎牛血清、1×

105U/L青霉素、1×

105U/L链霉素）的培养瓶中，在37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内培养，隔日更换新培养液一次。

平均3～4天传代一次。

　　1.2.2实验分组

　　将培养的Hela细胞随机分为用药组和对照组。

用药组：

分为3组，分别含有浓度为5、10、20μmol/L的米非司酮，各组DMEM培养液中乙醇终浓度小于0.2%，含有7%胎牛血清。

对照组：

培养液中不含米非司酮，只含与用药组相同浓度的乙醇和胎牛血清。

　　1.2.3实验方法

　　1.2.3.1流式细胞技术（FCM）检测细胞周期和细胞凋亡率

　　取对数生长期的Hela细胞，制成单细胞悬液，每瓶4×

105个细胞接种于100ml培养瓶中，培养24h后观察细胞已贴壁，换新培养液，分4组（如上所述），每组设3个样本，加入含有不同浓度米非司酮的培养液，继续培养72h后，制成单细胞悬液，收集细胞于流式管中，离心（1500r/min、5min）弃上清，PBS洗涤2遍，沿管壁缓慢加入70％冰乙醇（4℃）1ml，使细胞悬浮固定至少18h后，离心弃上清，PBS洗涤2遍，每管加入PI1ml染色，4℃避光1h，置流式细胞仪检测分析。

　　1.2.3.2Westernblot法检测NF-κBp65的表达

　　取对数生长期的Hela细胞，制成单细胞悬液，以每孔8×

105个细胞接种于6孔培养板中，24h后观察细胞已贴壁，分组施加药物干预。

分组情况如上所述，每组重复3个孔，继续培养72h，收集细胞，按一种新改进的核蛋白的抽提方法［3］提取核蛋白。

将核蛋白提取液进行蛋白浓度测定后，依次行SDS-PAGE电泳、半干转膜、抗原-抗体反应、显色、拍照。

实验过程中，以β-actin作为内参进行检测，保证实验结果的准确性。

最后用ImageJ图像分析软件对条带进行分析，测定其灰度值。

　　1.3统计学处理

　　应用SigmaStat2.03软件进行统计分析，各组数据均以±

s表示，采用单因素方差分析，P＜0.05表明差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1米非司酮对Hela细胞增殖周期及凋亡率的影响

　　与对照组比较，3个浓度的米非司酮作用72h后，均可使Hela细胞凋亡率、G0/G1期细胞比例显著增加（P＜0.01），S期、G2/M期细胞比例减少（P＜0.05），而且随着药物浓度的增加，其作用逐渐增强，呈剂量依赖性，各用药组间两两比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。

见表1。

表1米非司酮对Hela细胞增殖周期及凋亡率的影响（略）

　　2.2米非司酮对Hela细胞NF-κBp65表达的影响

　　Westernblot结果显示，用药组NF-κBp65蛋白相对表达量均明显低于对照组，差异均具有统计学意义（P＜0.01）；

随着浓度的增大，米非司酮对NF-κBp65蛋白表达下调作用明显增强，且各实验组之间的差异均具有统计学意义（P＜0.01）。

见图1、表2。

表2米非司酮对Hela细胞NF-κBp65表达的影响（略）

　　3讨论

　　米非司酮是惟一用于临床的孕激素受体拮抗剂，目前临床上主要用于终止早中期妊娠等，近年研究证实，米非司酮还具有抗肿瘤、增强抗癌药物疗效等新用途。

目前已有用米非司酮治疗子宫肌瘤［4］、子宫内膜癌［5］和卵巢癌［6］的报道，且研究发现，米非司酮对孕激素受体阳性和孕激素受体阴性的卵巢癌细胞系均具有明显的生长抑制作用［7］。

这意味着孕激素受体并不是米非司酮抗肿瘤细胞增殖的必需要素，米非司酮除作为孕激素受体拮抗剂发挥抗肿瘤作用外，还可以通过其他途径抑制肿瘤的生长。

　　本实验发现不同浓度的米非司酮（5、10、20μmol/L）作用于宫颈癌Hela细胞72h后，均可使Hela细胞处于G0/G1期的比例增加，使大部分癌细胞不能进入S期及G2/M期,减少了S期及G2/M期细胞数，并使细胞凋亡率明显增高。

这与Rose等［8］研究的米非司酮对卵巢癌细胞的作用基本一致，说明米非司酮对宫颈癌Hela细胞体外生长具有明显的促凋亡作用，而且米非司酮可能是一种特异性细胞周期抑制药物，通过抑制细胞DNA的合成，使多数肿瘤细胞阻滞在G0/G1期，减少其进入S期及G2/M期，从而抑制肿瘤细胞的生长。

　　1986年NF-κB首先在B细胞中被发现，是真核细胞的转录因子，在调节细胞凋亡以及肿瘤生长抑制的信息传递过程中起着重要作用［9］。

正常情况下，NF-κB在胞质内与抑制性蛋白（IκBα、IκBγ、Bcl-3等）结合，以无活性状态存在于胞质中。

但当有刺激因子如肿瘤坏死因子、放射线、病毒和细菌等作用时，可激活NF-κB系统，活化的NF-κB转位进入细胞核，能促进具有细胞保护和抗凋亡作用的基因转录和表达，从而发挥抗凋亡、促进细胞生长的作用。

NF-κBp65是NF-κB在体内发挥生理功能的亚单位之一，因此，通过NF-κB信号通路抑制NF-κB活化、下调NF-κBp65的表达，可诱导细胞凋亡，抑制肿瘤生长。

Han等［10］研究发现，米非司酮对NF-κB的调节作用以及NF-κB对细胞凋亡的调节作用具有细胞特异性，并与不同的刺激因素有关。

Kalkhoven等［11］研究发现，在孕激素受体阳性的COS-1细胞、人类乳腺癌T47D细胞，米非司酮能够通过与孕激素受体结合增强孕激素受体介导的对NF-κBp65表达的抑制作用。

　　多项研究表明，NF-κB在宫颈癌组织中高表达并与宫颈癌的发生和发展密切相关［12］。

本研究采用Westernblot方法，分析不同浓度的米非司酮对人宫颈癌Hela细胞核蛋白中NF-κBp65蛋白表达的影响，结果显示，与对照组相比，3种浓度的米非司酮均能下调NF-κBp65蛋白的表达，其作用呈剂量依赖性。

　　综上所述，我们认为，米非司酮对人宫颈癌Hela细胞具有调节细胞周期、诱导细胞凋亡的抗肿瘤作用和抑制NF-κB的活化、下调NF-κBp65蛋白表达的功能。

据此推测，米非司酮可能通过NF-κB信号通路抑制NF-κB的活化，下调NF-κBp65蛋白表达，从而诱导Hela细胞凋亡，抑制其生长。

而且米非司酮口服耐受性良好，不良反应小，有望成为临床上治疗宫颈癌的有效药物或提高放疗、化疗敏感性的辅助用药，但是其确切的抗肿瘤作用机制尚需进一步研究，米非司酮对宫颈癌的确切疗效和适用性尚需通过体内实验（包括动物实验和临床实验）进一步研究。

【参考文献】

　　［1］程大丽,张淑兰.核转录因子与细胞周期蛋白D1在宫颈癌中的表达及相关研究［J］.中国现代医学杂志,2005,1