研究生生物技术综合试验指导Word格式.docx

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3.掌握发酵过程中的参数测定和在线控制，包括：

pH，DO，温度，搅拌速度，生物量，残糖含量，产物生成量，消泡，CO2。

4.运用所学发酵工程基本理论分析发酵过程中的实验数据，讨论某一特定菌株的发酵规律

二、淀粉酶水解原理及制备工艺

1.根据作用的方式可分为α-淀粉酶（EC3.2.1.1.）与β-淀粉酶（EC3.2.1.2.）。

（1）α-淀粉酶广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物。

微生物的酶几乎都是分泌性的。

此酶以Ca2+为必需因子并作为稳定因子，既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地切断α-1,4-链。

因此，其特征是引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应的消失，最终产物在分解直链淀粉时以麦芽糖为主，此外，还有麦芽三糖及少量葡萄糖。

另一方面在分解支链淀粉时，除麦芽糖、葡萄糖外，还生成分支部分具有α-1，6-键的α-极限糊精。

一般分解限度以葡萄糖为准是35-50％，但在细菌的淀粉酶中，亦有呈现高达70％分解限度的（最终游离出葡萄糖）。

（2）β-淀粉酶与α-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α-1,4-葡聚糖链。

主要见于高等植物中（大麦、小麦、甘薯、大豆等），但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。

对于象直链淀粉那样没有分支的底物能完全分解得到麦芽糖和少量的葡萄糖。

作用于支链淀粉或葡聚糖的时候，切断至α-1,6-键的前面反应就停止了，因此生成分子量比较大的极限糊精。

从上述的α-淀粉酶和β-淀粉酶的作用方式，分别提出α-1,4-葡聚糖-4-葡萄糖水解酶（α-1，4-glucan4-glucanohydrolase）和α-1,4-葡聚糖-麦芽糖水解酶（α-1,4-glucanmaltohydrolase）的名称等而被使用。

2．根据作用的温度分为耐高温淀粉酶（一般耐受温度80℃-100℃），中温（30℃-50℃）淀粉酶以及低温（耐受温度20℃以下）

3．根据作用的酸碱环境分为耐酸性淀粉酶（一般耐受pH5.0以下），耐碱性淀粉酶（耐受pH8.0以上）。

4.本综合实验就是运用微生物发酵淀粉酶速度快活力高的特点，制备细菌淀粉酶，为《酶工程》、《分离工程》等专业课提供酶源。

通过掌握淀粉酶发酵工艺，为将来进入发酵工厂生产相关产品打下坚实基础。

三、实习操作步骤:

1.介绍机械搅拌通风发酵罐的基本结构（一个上午）

2.培养基的配制:

配方:

3％麸皮，消泡剂0.3%（植物油），配制70L;

3．pH电极的标定：

pH4.00，pH6.86两点标定

4．装料、灭菌（121℃，30min）

注意各阀门的开启，红绿，黑色代表的含义，灭菌时关闭所有绿色阀门，打开红色阀门，使蒸汽从夹套、空气进口管加热发酵罐，并使少量蒸汽流经取样口，对取样口进行灭菌，开动搅拌电机至100r/min，充分灭菌。

灭菌完毕，关掉所有蒸汽阀（红色）、加热器底部排水阀、放料口处取样阀。

5．溶氧电极“0”值的标定

灭菌完毕，此时发酵罐中为100％水蒸气分压，标定溶氧为“0”。

或者饱和亚硫酸盐标定为“0”。

6．降温冷却

开启冷却循环水，使冷却水从夹套对发酵罐进行降温;

同时开启鼓风机，使少量空气进入发酵罐，维持正压。

7．取样操作:

旋松放料口螺旋阀门（开启方向与正常螺旋相反），打开取样阀，先弃掉约20-30mL样液，再收集50-100mL灭菌培养基液体，关闭放料阀、取样阀。

样液用4层纱布过滤样液，样液作测定残糖含量、生物量、淀粉酶活力，蛋白质含量测定。

8．接种

当罐温降低至40℃以下，采用火圈法接种摇瓶种子100mL，接种量为1.0％。

9．溶氧电极“100”值的标定

搅拌速度开至最大，通气量开至最大，标定溶氧为“100”。

10．设定发酵参数，运行发酵指令

温度30-35℃；

通气量6-8L/min（手动设置），维持正压0.02-0.03MPa；

搅拌速度200-300r/min；

自然pH值

四、根据发酵周期、每班分成6-8组，每组4人。

发酵过程参数的检测

根据每12小时取样测定一次（早上8:

00-12:

00，晚上7:

00-10:

00），从取样口取样50-100mL发酵醪液，4层纱布过滤，取滤液为待侧液。

1.pH值，直接读数梅特勒pH电极显示值

2.温度，直接读数温度电极显示值

3.通气量，直接读数溶氧电极显示值

4.搅拌速度，直接读数电机转速显示值

5.残糖含量测定（DNS法）

（1）葡萄糖标准曲线的制作:

配制5mmol/L的葡萄糖标准溶液，按下表操作

刻度试管号

1

2

3

4

5

葡萄糖标液（mL）

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

蒸馏水（mL）

DNS（mL）

2.0

沸水反应5min，冷却后定容至20mL

OD540

葡萄糖量（mmol/l）

作图时用

得回归方程;

Y＝5.52X＋0.1132（X为OD540nm，葡萄糖浓度µ

mol/mL）线性相关系数R2=0.9978。

（2）取20mL刻度试管3支，1号加1mL蒸馏水管作对照管（作空白消零）.2、3号管作待测管分别加入1mL待侧发酵液（稀释0-20倍，根据上一次实验结果确定稀释倍数），三管加显色剂DNS试剂2.0mL。

（3）沸水反应5min，反应后迅速冷却定容定容至20mL，以加1mL蒸馏水的试管作空白消零。

用721型分光光度计在540nm处比色，测得OD540nm值。

取平均值。

（4）根据葡萄糖标准曲线方程计算并记录残糖量。

残糖量;

y×

稀释倍数（mmol/L）

6.生物量的测定（比浊法）

（1）按取样操作要求，在发酵培养接种前从取样口取50-100mL培养基，4层纱布过滤，稀释20倍，摇匀后用721型分光光度计在可见光590nm测OD值作为生物量的对照（5秒内读数），蒸馏水作空白。

（2）按规定时间，定时从取样口取50-100mL发酵液，发酵液用4层纱布过滤（稀释0-20倍，根据上一次实验结果确定稀释倍数倍），用721型分光光度计，在可见光590nm测OD值作为生物量，蒸馏水作空白。

（3）根据生物量标准曲线方程y＝1.56*发酵液稀释倍数*OD发酵液-1.56*培养基稀释倍数*OD培养基（g湿菌体/L发酵液）计算并纪录生物量

7.淀粉酶发酵活力的测定

Ⅰ酶活力的定义

pH6.0，70℃下，每min催化可溶性淀粉水解生成1μmol麦芽糖所需要的酶量为1个酶活力单位（IU/mL）（参照实验十三）

Ⅱ酶活的测定方法（DNS法）

（1）麦芽糖标准曲线的制作:

配制5mmol/L的麦芽糖标准溶液，按下表操作

麦芽糖标液（mL）

0.0

麦芽糖量（μmol）

作图使用

3.0

4.0

5.0

得回归方程:

Y＝4.87X＋0.2134，线性相关系数R2=0.9924，（X为OD540nm，Y为麦芽糖量μmol/mL）

（2）取20mL刻度试管3支，1号管作对照管，2、3号管作待测管。

分别加入0.5mL待侧酶液（稀释0-150倍，根据上一次实验结果确定稀释倍数），对照管先加0.5mol/LNaOH溶液0.5mL灭酶活，反应管加pH6.0，0.05mol/L磷酸缓冲液0.5mL，三管同时加0.5mL1%淀粉溶液作为反应底物（淀粉现配现用）。

（3）70℃恒温水浴锅准确反应5min。

（4）对照管加pH5.6、0.05mol/L乙酸酸缓冲液0.5mL，反应管再加入0.5mol/LNaOH溶液0.5mL灭酶活，三管各加显色剂DNS试剂2.0mL，沸水反应5min，反应后迅速冷却定容定容至20mL。

（5）用721型分光光度计在540nm处比色，用对照管消零，测得OD540nm值。

（6）根据麦芽糖标准曲线方程求麦芽糖生成量，根据Y＝[y×

（稀释倍数）/[5（反应时间）×

0.5（mL）]（IU/mL酶液）计算发酵液中的酶活力。

8、蛋白质含量的测定

（1）蛋白质标准曲线的制作:

配制1mg/mL的牛血清蛋白标准溶液，按下表操作

牛血清蛋白标液（mL）

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.10

考马斯亮兰G－250（mL）

OD595

蛋白质浓度（mg/mL）

静置2min，以加0.1mL蒸馏水的试管为空白，用721型分光光度计在可见光595nm处测定OD595值，得线性回归方程:

y＝1.344X＋0.2134，线性相关系数R2=0.9955，（X为OD595nm，Y为蛋白质浓度量mg/mL）

（2）蛋白质含量测定:

取10mL刻度试管3支，1号管作对照管，2、3号管作待测管。

1号管加蒸馏水0.1mL，2、3号管分别加适当稀释发酵过滤液0.1mL（稀释0-20倍，根据上一次实验结果确定稀释倍数），各加5mL考马斯亮兰G－250，静置2min，以加0.1mL蒸馏水的试管为空白，用721型分光光度计在595nm处测定OD595值，取平均值，根据线性回归方程计算蛋白质浓度（mg/mL）

五、放罐及发酵后处理（属于生物工程下游技术，略）

1.放罐

2过滤酶液（2层纱布过滤）或者天津工大天膜中空纤维除菌膜除菌。

4.超滤（截留分子量10000Da）浓缩，计算浓缩比，测定酶液回收率。

5.调配防腐，加0.5%山梨酸钠，1.0%甘油作为稳定剂。

6.包装保存

六、发酵过程数据的分析处理

1.根据在线检测的实验结果对发酵时间用Excel作图（每组的实验结果统一汇总）

2.分析讨论各参数变量与淀粉酶产出的关系以及各变量之间的内在联系

温度对微生物的生长和产物生成的影响:

溶氧对微生物的生长和产物生成的影响:

pH值对微生物的生长和产物生成的影响:

生物量（即菌体浓度）随时间的延长有什么样的变化？

残糖随时间的延长有什么样的变化？

蛋白质随时间的延长有什么样的变化？

淀粉酶随时间的延长有什么样的变化？

七细菌淀粉酶酶系分析

1、非变性凝胶电泳试剂：

单体溶液：

aArc29.2gBis0.8g定容至100mL

b分离胶缓