自己总结透彻易懂PCR RTPCR原理范文Word文档格式.docx

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PCR（聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°

高温时变性会变成单链，低温（经常是60°

C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°

C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5'

-3'

）的方向合成互补链。

基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。

引物（primer），是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此引物的3′-OH，必须是游离的。

DNA聚合酶（DNApolymerase）是细胞复制DNA的重要作用酶。

DNA聚合酶,以DNA为复制模板，从将DNA由5'

端点开始复制到3'

端的酶。

DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具备模板、引物、dNTP等的情况下）及其相辅的活性。

dNTP:

deoxy-ribonucleosidetriphosphate（三磷酸脱氧核糖核苷）的缩写。

是dATP,dGTP,dTTP,dCTP的统称。

在生物DNA合成，以及PCR聚合酶链反应中起原料作用。

由等摩尔数的dATP、dTTP、dGTP和dCTP混合而成。

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。

双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。

在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。

因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

DNA的复性指变性DNA在适当条件下,二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象,它是变性的一种逆转过程。

热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性,此过程称之为"

退火"

（annealing）。

这一术语也用以描述杂交核酸分子的形成（见后）。

DNA的复性不仅受温度影响,还受DNA自身特性等其它因素的影响。

但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。

发现耐热DNA聚合酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。

寡核苷酸:

是一类只有20个以下碱基的短链核苷酸的总称（包括脱氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA内的核苷酸），寡核苷酸可以很容易地和它们的互补对链接，所以常用来作为探针确定DNA或RNA的结构，经常用于基因芯片、电泳、荧光原位杂交等过程中。

寡核苷酸合成的DNA（脱氧核糖核酸）可以用于链聚合反应，能放大确定几乎所有DNA的片段，在这个过程中寡核苷酸是作为引物，和DNA中标的的互补片段结合，作成DNA的复制品。

调控寡核苷酸用于抑制RNA片段，防止其翻译成蛋白，在制止癌细胞活动方面能起一定的作用。

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：

模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板DNA与引物的退火（复性）：

模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：

DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

碱基互补配对原则theprincipleofcomplementarybasepairing

在DNA分子结构中，由于碱基之间的氢键具有固定的数目和DNA两条链之间的距离保持不变，使得碱基配对必须遵循一定的规律，这就是Adenine（A，腺嘌呤）一定与Thymine（T，胸腺嘧啶）配对，Guanine（G，鸟嘌呤）一定与Cytosine（C，胞嘧啶）配对，反之亦然。

碱基间的这种一一对应的关系叫做碱基互补配对原则。

DNA半保留复制是：

DNA在进行复制的时候链间氢键断裂，双链解旋分开，每条链作为模板在其上合成互补链，经过一系列酶（DNA聚合酶、解旋酶、链接酶等）的作用生成两个新的DNA分子。

子代DNA分子其中的一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，这种方式称半保留复制。

摘要：

类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引

物.PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成.

PCR技术的基本原理　

类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物.

模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备；

②模板DNA与引物的退火（复性）：

模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板.每完成一个循环需2～4分钟,2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍.到达平台期（Plateau）所需循环次数取决于样品中模板的拷贝.

PCR的反应动力学　

PCR的三个反应步骤反复进行,使DNA扩增量呈指数上升.反应最终的DNA扩增量可用Y＝（1＋X）n计算.Y代表DNA片段扩增后的拷贝数,X表示平均每次的扩增效率,n代表循环次数.平均扩增效率的理论值为100%,但在实际反应中平均效率达不到理论值.反应初期,靶序列DNA片段的增加呈指数形式,随着PCR产物的逐渐积累,被扩增的DNA片段不再呈指数增加,而进入线性增长期或静止期,即出现“停滞效应”,这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素.大多数情况下,平台期的到来是不可避免的.

PCR扩增产物　

可分为长产物片段和短产物片段两部分.

短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间,是需要扩增的特定片段.短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的,以一个原始模板为例,在第一个反应周期中,以两条互补的DNA为模板,引物是从3’端开始延伸,其5’端是固定的,3’端则没有固定的止点,长短不一,这就是“长产物片段”.进入第二周期后,引物除与原始模板结合外,还要同新合成的链（即“长产物片段”）结合.引物在与新链结合时,由于新链模板的5’端序列是固定的,这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点,保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”.

不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加,而“长产物片段”则以算术倍数增加,几乎可以忽略不计,这使得PCR的反应产物不需要再纯化,就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用.

标准的PCR反应体系：

10×

扩增缓冲液　10ul

4种dNTP混合物各200umol/L

引物　　　　　各10～100pmol　

模板DNA　　　　0.1～2ug　

TaqDNA聚合酶　2.5u　

Mg2+　　　　　　1.5mmol/L

加双或三蒸水至　100ul

PCR反应五要素：

参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物：

引物是PCR特异性反应的关键,PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度.理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增.

RT-PCR技术概述

RT-PCR为反转录PCR（reversetranscriptionPCR）和实时PCR（realtimePCR）共同的缩写。

逆转录PCR，或者称反转录PCR（reversetranscription-PCR,RT-PCR），是聚合酶链式反应（PCR）的一种广泛应用的变形。

在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。

1逆转录PCR

由一条RNA单链转录为互补DNA（cDNA）称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。

随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。

原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互补DNA。

cDNA是互补脱氧核糖核酸，是与RNA链互补的单链DNA，以其RNA为模板，在适当引物的存在下，由RNA与DNA进行一定条件下合成的。

DNA（Deoxyribonucleicacid），中文译名为脱氧核糖核酸，是染色体的主要化学成分，同时也是基因组成的，有时被称为“遗传微粒”。

MessengerRNA（mRNA）——信使核糖核酸:

携带遗传信息，在蛋白质合成时充当模板的RNA。

从脱氧核糖核酸（DNA）转录合成的带有遗传信息的一类单链核糖核酸（RNA）。

它在核糖体上作为蛋白质合成的模板，决定肽链的氨基酸排列顺序。

mRNA存在于原核生物和真核生物的细胞质及真核细胞的某些细胞器（如线粒体和叶绿体）中。

cDNA互补脱氧核糖核酸:

为具有与某mRNA（信使RNA）链呈互补的碱基序列的单链DNA即complementaryDNA之缩写，或此DNA链与具有与之互补的碱基序列的DNA链所形成的DNA双链。

与RNA链互补的单链DNA，以其RNA为模板，在适当引物的存在下，由依赖RNA的DNA聚合酶（反转录酶）的作用而合成，并且在合成单链cDNA后，在用碱处理除去与其对应的RNA以后，以单链cDNA为模板，由依赖DNA的DNA聚合酶或依赖RNA的DNA聚合酶的作用合成双链cDNA。

真核生物的信使RNA或其他RNA的cDNA，在遗传工程方面广为应用。

在这种情况下，mRNA的cDNA，与原来基因的DNA（基因组DNA，genomicDNA）不同而无内含子；

相反地对应于在原来基因中没有的而在mRNA存在的3′末端的多A序列等的核苷序列上，与exon序列、先导序列以及续序列等一起反映出mRNA结构。

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