色氨酸发酵设计精编版Word文件下载.docx
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年产量100吨
要求：
（1）分批发酵生产；
（2）主发酵罐的尺寸及附件的设计；
前言
L-色氨酸是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸,为白色或略带黄色叶片状结晶或粉末，在水中溶解度1014g（25℃），溶于稀酸或稀碱，在碱液中较稳定，强酸中分解。
微溶于乙醇，不溶于氯仿、乙醚。
它是人体和动物生命活动中必需氨基酸之一，对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要作用，被称为第二必需氨基酸，在生物体内，从L-色氨酸出发可以合成5-羟基色胺的激素以及色素、生物碱、辅酶、植物激素等生理活性物质，可以预防和治疗糙皮病，同时具有消除精神紧张、改善睡眠等功效。
另外，由于色氨酸是一些植物蛋白中比较缺乏的氨基酸，用他强化食品和做饲料添加剂对提高植物蛋白质的利用率具有重要的作业，它是继蛋氨酸和赖氨酸之后的第三大饲料添加氨基酸。
[1]
目前世界L-色氨酸的年产约为10000多吨，市场增长率超过10%，作为饲料添加剂使用的色氨酸有数百吨，中国主要是高价格限制了她的应用。
世界上主要生产厂家是日本的昭和电工、协和发酵和三井化学公司采用发酵方法生产色氨酸，赢创德固赛则兼有发酵法和合成法生产色氨酸。
[2]
L-色氨酸的最早生产是靠化学合成法和蛋白质水解法，随着对微生物法生产L-色氨酸研究的不断深入，这种方法已经处于主导地位。
微生物法大体上可以分为直接发酵法、微生物转化法和酶法。
1概述
1.1色氨酸发酵工艺流程
色氨酸生产菌的选育一般是以大肠杆菌、黄色短杆菌、谷氨酸杆菌等作为出发菌株，通过基因操作定向改造生物合成途径的正常调节。
表1色氨酸发酵工艺流程图
发酵液
↓板框过滤
滤液
↓树脂吸附与解析
解析液
↓纳滤浓缩
浓缩液
↓洗涤
洗涤液
↓活性炭脱色
脱色液
↓喷雾干燥
精粉
1.2色氨酸发酵菌种
本设计选用E.coli基因工程菌，其发酵单位为25g/L
1.3发酵过程中的代谢参数
1.3.1物理参数
1.3.1.1温度对发酵的影响及调控
大肠杆菌的最适生长温度为37℃，温度过高，会影响产物表达和乙酸等副产物的生产，同时，在基因工程菌高密度培养过程中，温度的变化还与质粒拷贝数的变化有关。
在发酵前期，色氨酸的浓度随着细胞的生长而逐渐提高，但进入生长稳定期后，影响色氨酸合成因素除了细胞生物量外，还有质粒的稳定性。
当温度为32℃时，产酸水平达到最大值，过低或过高的温度均不利于色氨酸的合成；
36℃时虽然获得了最高的菌体量，但产酸却不是最高，质粒丢失比较严重；
28℃时，质粒基本不会丢失，但过低的温度使菌体生长缓慢，产酸下降。
因此，在本次设计中，色氨酸发酵过程中温度控制策略为：
0~16h发酵温度为30℃，16h后缓慢升温至36℃，升温方式为每小时0.5℃，利用发酵罐的温度顺控模式进行自动控制。
表2色氨酸发酵过程中的温度顺序控制表
时间（h）
温度（℃）
30
22
32.5
27
35
18
30.5
23
33
26
35.5
19
31
24
33.5
29
36
20
31.5
25
34
45
21
32
34.5
1.3.1.2泡沫对发酵的影响及调控
发酵过程中因通气搅拌和代谢产生的气体是产生泡沫的原因。
产生少量泡沫是正常的，但是泡沫产生过多时会造成大量逃液，发酵液从排气管路或轴封逃出而增加染菌机会，严重时还会影响通气搅拌的正常进行，从而影响菌的呼吸。
调控方法：
使用消泡剂同时采用机械强烈震动或压力变化进行消泡。
1.3.1.3发酵罐压力
发酵过程中发酵罐应维持一定的正压力，这样可以防止因外界空气中的杂菌侵入而污染发酵液。
同时罐压的高低还与氧和二氧化碳在培养液中的溶解度有关，间接影响代谢。
罐内压力一般维持在2×
104～5×
104Pa。
表3发酵过程中物理参数的测量方法和意义
名称
测定方法
意义及主要作用
发酵温度/℃或K
温度计
保证生长，繁殖和产物合成
发酵罐压力/Pa或㎏·
m-2
压力计
维持正压，增加溶氧量
空气流量/m3·
min-1或L·
min-1
流量计
供养、排出废气
搅拌转速/r·
转速表
使物料和气体混合
发酵液黏度/Pa·
s
粘度计
反映菌生长情况
发酵罐装量/m3或L
液位计
反映发酵生产批量
发酵液密度/g·
L-1
加消泡剂/㎏
密度计
反映发酵液性质
反映发酵液性质和代谢情况
1.3.2化学参数
1.3.2.1溶氧浓度对发酵的影响及调控
大肠杆菌为兼性厌氧菌，在其生长期时需要大量的氧气，但是在发酵过程中，表现出厌氧的性质。
所以在发酵前期应保持一定的通风量，在发酵时减少通风量。
根据经验值，在大肠杆菌生长阶段，溶解氧浓度为30%，在产酸阶段的溶解氧浓度为20%，有利于菌体的生长及以后的发酵。
调控：
氧浓度低，可以增大搅拌功率，增加通气量或选用氧载体等，若氧浓度增高，则减慢搅拌速率，减小通气量，同时控制补料速度。
1.3.2.2pH对发酵的影响及调控
pH对生产菌的生长具有非常明显的影响，因其影响生产菌的酶活性，改变细胞膜的通透性，影响培养基中某些组分中间代谢产物的解离，从而影响菌体对营养物质的吸收，改变菌体的代谢途径，从而使产物产量下降。
在线检测发酵液的pH，根据发酵的不同阶段对发酵液PH值进行调控，在发酵液pH值不稳定的时候可以选择加简单的酸碱盐，铵盐，或同时加入碳氮源等方法来调节发酵液pH值。
在本设计中，主要加入氨水来调节pH值。
1.3.2.3CO2对发酵的影响及调控
CO2对生产有抑制作用，当CO2浓度过高时将严重抑制菌体的生长，影响产物的合成。
同时CO2浓度过高生成大量的HCO3-，使溶液pH值降低，影响生产菌细胞膜通透性，从而影响产物产量。
调整搅拌速率与通气量，定时检测CO2的释放率。
表4发酵过程中化学参数的测量方法和意义
酸碱度（pH）
pH传感器
反映菌体的代谢情况
溶解氧/mg·
溶氧传感器
反映氧的供给和消耗情况
排气氧浓度/Pa
氧传感器
了解氧的消耗情况
氧化还原电势/mV
电势传感器
排气二氧化碳/％
红外吸收
了解菌体的呼吸情况
氨基酸浓度/mg·
mL-1
取样测定
了解氨基酸的变换情况
总糖和还原糖/g·
了解糖的变化和消耗情况
前体或中间体/mg·
了解产物合成情况
无机盐浓度（Fe2+,NH4+）/mol或％
了解无机离子对发酵的影响
1.3.3生物参数
1.3.3.1菌体浓度对发酵的影响及调控
菌体浓度的大小和变化速度对菌体的生化反应都有影响，更是对发酵产物的得率有着重要的影响。
根据发酵产物产率P=QPmC（X）[QPm——最大生成速率：
C（X）——菌体浓度][3]得出，菌浓度越大，产物的产量也就越大。
但是如果菌体浓度过高，就会产生营养物质消耗过快，发酵液营养成分发生明显变化。
同时由于菌体浓度过高，发酵液粘度增加，溶氧量减少，进一步影响发酵的进行。
定时抽取发酵液，测量OD值。
依靠调节发酵液各成分的的比例，将菌体浓度控制在合适范围内，避免产生过浓的菌体量。
1.3.3.2基质溶度对发酵的影响及调控
即发酵液中碳、氮重要营养物质浓度，他们的含量对生产菌的生长和产物的合成由着重要影响。
若碳源过高，则容易造成较低的pH，抑制菌体生长，碳源不足，则容易引起菌体的衰老和自溶。
若氮源过高，会是菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代谢产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少，从而影响产量。
定时抽取发酵液，测定碳、氮等基质的浓度。
1.3.3.3染菌对发酵的影响及调控
发酵过程中应严格防止污染杂菌，杂菌会造成发酵液营养物质的迅速消耗，同发酵菌产生竞争作用，降低产量。
若是在发酵后期污染少量杂菌，则影响不大。
定时抽取发酵液进行检测，检查是否有杂菌污染。
主要方法有：
平板划线培养或者斜面培养检查法，显微镜检查法，肉汤培养法。
发现发酵液被杂菌污染，视发酵阶段不同，处理方法也不同：
若在种子培养期染菌，则经灭菌后弃之，然后对种子罐、管道等进行仔细检查及彻底灭菌；
若发酵前期染菌，则可将培养基重新灭菌，再接入种子进行发酵；
若中后期染菌，如轻微染菌，则加入适当的杀菌剂或抗生素及正常的发酵液等。
发酵液中一般加入50µ
g/ml的四环素。
1.3.4发酵终点的判断
发酵时间需要考虑经济因素，以最低的成本来获得最大生产能力的时间为最适发酵时间。
放罐过早，营养成分得不到有效利用，对成本造成浪费；
放罐过晚，菌体自溶，加大后期产物的分离纯化的难度，还会使产品的产量降低。
一般判断放罐时间的主要指标有产物浓度、氨基氮、菌体形态、pH值、培养液的外观、粘度等。
1.3.5发酵过程的自动控制
自动控制系统由控制器和被控对象两个基本因素组成。
发酵过程采用的基本自控主要有前馈控制，反馈控制和自适控制。
本设计采用反馈控制。
原理：
被控过程的输出量X（t）被传感器检测，以检测量Y（t）反馈到控制系统，控制器使之与预定的值r（t）（设定点）进行比较，得出偏差e，然后采用某种控制算法根据这一偏差e确定控制动作U（t）[4]。
1.4培养基配方的确定
1.4.1种子罐培养基配方
表5种子灌培养基配方
葡萄糖
硫酸铵
玉米浆
豆饼水解液
MgSO4·
7H2O
FeSO4·
KH2PO4
MnSO4.H2O
PH
3%
0.5%
4.0ml
2.0ml
0.04%
0.001%
0.1%
7.0~7.2
1.4.2发酵罐培养基配方
表6发酵培养基配方（g/l）
130
22ml
25ml
（NH4）2SO4
40
Phe
0.15
Tyr
0.4
MnSO4·
H2O
0.01
VB1
100µ
g
VH
50µ
1.4.3培养基的灭菌
对于液体培养基，我国仍采用蒸汽加热灭菌的较多。
本设计采用薄板换热器连续灭茵流程。
培养液在设备中同时完成预热、加热灭菌、维持及冷却的过程。
待灭菌培养液的预热过程同时为灭菌培养浪的冷却过程，节约了加热蒸汽及冷却水的消耗[5]。
2发酵罐及其附属设备
2.1发酵罐的结构形式
2.1.1物料衡算：
已知相关参数：
色氨酸的年产量：
G=100（吨）；
发酵平均单位：
25000u/ml；
一年的工作天数：
T1=300（天）；
发酵周期：
T2=2天；
发酵周期=每罐批发酵时间+辅助时间；
辅助时间=进料时间+灭菌操作时间+移种时间+放罐压料时间+清洗检修时间。
所以，发酵周期数：
N=T1/T2=150（个）
提炼总收率：
60%[6]
每个发酵周期所产生的色氨酸的量为：
g=G/N=100/150=0.6
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