PCR引物流程设计详解.docx
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PCR引物流程设计详解
PCR引物设计流程详解
本文目的:
复制出IL-4基因片段
一、查找基因序列
1、进入NCBI主页,下拉选框选择Nucleotide,在搜索栏输入要查找的目的基因,即IL-4,点击搜索
2、在搜索结果选择灵长类(Homosapiens)
2、在灵长类IL-4基因中选择需要的mRNA序列
3、查看基因的相关信息
外显子区域
CDs区域
4、点击FASTA格式,并将序列保存到文档
二、使用primerpremier5.0设计引物
1、建立新文件,将所得的序列复制进输入框内
2、点击搜索按钮,搜索引物
3、设置引物设计参数(因为在之前查找基因序列的时候获知,外显子区域分别为:
1-200、201-248、249-425、426-618,又知在引物设计时引物位置最好跨越一个内含子,PCR产物长度通常为100-150bp,故设定上游引物位置为201-248,下游引物位置为249-425,产物长度为100-150bp)
4、确认条件后,显示搜索结果
4、双击选中得分最高的引物查看引物情况
(上图为上游引物情况,下图为下游引物情况)
5、将设计的上下游引物复制出来,保存到文档中
三、使用oligo6.0对设计的引物进行评价
1、建立新文件,将从cnki上获得的cDNA复制进输入框,并点击accept接收
2、接收后显示出该序列的相关信息
3、点击edit按钮录入用primer设计的上游引物,每一次输入新数据后都需要点击accept按钮接收
4、同理,录入下游引物
5、分析上下游引物二聚体形成情况
6、分析上下游引物发卡形成情况
7、分析上下游引物GC%
8、检测上下游引物与PCR模板其它位置错配情况
9、分析PCR整体情况
四、引物特异性检验(primerblast)
1、进入NCBI主页,并选择blast
2、选择primerblast
3、在输入框内输入模板序列和上下游引物,并设定对比数据库,点击getprimer进行对比
4、查看blast结果
Blast结果显示,尽管IL-4与其它基因有相似区,但是引物的3’端没有完全互补。
故设计的引物能特异性的扩增出目的基因
爱人者,人恒爱之;敬人者,人恒敬之;宽以济猛,猛以济宽,政是以和。
将军额上能跑马,宰相肚里能撑船。
最高贵的复仇是宽容。
有时宽容引起的道德震动比惩罚更强烈。
君子贤而能容罢,知而能容愚,博而能容浅,粹而能容杂。
宽容就是忘却,人人都有痛苦,都有伤疤,动辄去揭,便添新创,旧痕新伤难愈合,忘记昨日的是非,忘记别人先前对自己的指责和谩骂,时间是良好的止痛剂,学会忘却,生活才有阳光,才有欢乐。
不要轻易放弃感情,谁都会心疼;不要冲动下做决定,会后悔一生。
也许只一句分手,就再也不见;也许只一次主动,就能挽回遗憾。
世界上没有不争吵的感情,只有不肯包容的心灵;生活中没有不会生气的人,只有不知原谅的心。
感情不是游戏,谁也伤不起;人心不是钢铁,谁也疼不起。
好缘分,凭的就是真心真意;真感情,要的就是不离不弃。
爱你的人,舍不得伤你;伤你的人,并不爱你。
你在别人心里重不重要,自己可以感觉到。
所谓华丽的转身,都有旁人看不懂的情深。
人在旅途,肯陪你一程的人很多,能陪你一生的人却很少。
谁在默默的等待,谁又从未走远,谁能为你一直都在?
这世上,别指望人人都对你好,对你好的人一辈子也不会遇到几个。
人心只有一颗,能放在心上的人毕竟不多;感情就那么一块,心里一直装着你其实是难得。
动了真情,情才会最难割;付出真心,心才会最难舍。
你在谁面前最蠢,就是最爱谁。
其实恋爱就这么简单,会让你智商下降,完全变了性格,越来越不果断。
所以啊,不管你有多聪明,多有手段,多富有攻击性,真的爱上人时,就一点也用不上。
这件事情告诉我们。
谁在你面前很聪明,很有手段,谁就真的不爱你呀。
遇到你之前,我以为爱是惊天动地,爱是轰轰烈烈抵死缠绵;我以为爱是荡气回肠,爱是热血沸腾幸福满满。
我以为爱是窒息疯狂,爱是炙热的火炭。
婚姻生活牵手走过酸甜苦辣温馨与艰难,我开始懂得爱是经得起平淡。
爱人者,人恒爱之;敬人者,人恒敬之;宽以济猛,猛以济宽,政是以和。
将军额上能跑马,宰相肚里能撑船。
最高贵的复仇是宽容。
有时宽容引起的道德震动比惩罚更强烈。
君子贤而能容罢,知而能容愚,博而能容浅,粹而能容杂。
宽容就是忘却,人人都有痛苦,都有伤疤,动辄去揭,便添新创,旧痕新伤难愈合,忘记昨日的是非,忘记别人先前对自己的指责和谩骂,时间是良好的止痛剂,学会忘却,生活才有阳光,才有欢乐。
不要轻易放弃感情,谁都会心疼;不要冲动下做决定,会后悔一生。
也许只一句分手,就再也不见;也许只一次主动,就能挽回遗憾。
世界上没有不争吵的感情,只有不肯包容的心灵;生活中没有不会生气的人,只有不知原谅的心。
感情不是游戏,谁也伤不起;人心不是钢铁,谁也疼不起。
好缘分,凭的就是真心真意;真感情,要的就是不离不弃。
爱你的人,舍不得伤你;伤你的人,并不爱你。
你在别人心里重不重要,自己可以感觉到。
所谓华丽的转身,都有旁人看不懂的情深。
人在旅途,肯陪你一程的人很多,能陪你一生的人却很少。
谁在默默的等待,谁又从未走远,谁能为你一直都在?
这世上,别指望人人都对你好,对你好的人一辈子也不会遇到几个。
人心只有一颗,能放在心上的人毕竟不多;感情就那么一块,心里一直装着你其实是难得。
动了真情,情才会最难割;付出真心,心才会最难舍。
你在谁面前最蠢,就是最爱谁。
其实恋爱就这么简单,会让你智商下降,完全变了性格,越来越不果断。
所以啊,不管你有多聪明,多有手段,多富有攻击性,真的爱上人时,就一点也用不上。
这件事情告诉我们。
谁在你面前很聪明,很有手段,谁就真的不爱你呀。
遇到你之前,我以为爱是惊天动地,爱是轰轰烈烈抵死缠绵;我以为爱是荡气回肠,爱是热血沸腾幸福满满。
我以为爱是窒息疯狂,爱是炙热的火炭。
婚姻生活牵手走过酸甜苦辣温馨与艰难,我开始懂得爱是经得起平淡。
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