超声联合微泡对内皮祖细胞体外增殖凋亡及细胞周期的阻碍Word文件下载.docx

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结论：

W·

cm-2超声联合微泡干与内皮祖细胞对细胞增殖活性、凋亡坏死及细胞周期无明显不良阻碍，为进一步应用超声微泡体内干与内皮祖细胞移植的研究提供可能。

【关键词】超声;

微泡；

内皮祖细胞；

增殖；

凋亡；

细胞周期

药物医治和血运重建技术的不断进展,使急性心肌梗死的病死率明显降低，但对心肌梗身后心力衰竭仍无有效的医治手腕。

内皮祖细胞（endothelialprogenitorcells，EPCs）是一类能够自我增殖和分化为内皮细胞的干细胞，能增进缺血组织血管新生，增加血流灌注，改善心功能。

而超声联合微泡作用能增进组织局部动脉生成，使灌注血流增加；

而且在毛细血管壁产生微孔，可能有利于细胞的靶向传输。

本实验在体外探讨超声联合微泡对EPCs增殖活性、凋亡坏死及细胞周期的阻碍，为进一步体内研究超声联合微泡增效EPCs医治缺血性心脏病提供依据。

1材料和方式

1．1要紧试剂和设备

淋巴细胞分离液FicollPaque（天津灏洋生物公司）、培育液EGM2（Cambrex公司）、纤维连接蛋白（Fn，Chemicon公司）；

DiI标记乙酰化低密度脂蛋白（DiIacLDL,MolecularProbe公司）、FITC标记荆豆凝集素I（FITCUEAI，Sigma公司）；

CCK8试剂盒（碧云天生物科技研究所）、PI凋亡试剂盒（南京凯基生物科技进展）；

含氟碳气体脂质体微泡（东南大学生物工程材料国家重点实验室）、荧光正立显微镜（Nicon公司）、CZT3超声同步医治仪（沈阳新乐康复医疗仪器厂）、BioRad酶标仪、FACSCalibur流式细胞仪。

细胞分离、培育和鉴定

于雄性中国小型猪胫骨近端抽取骨髓约20ml，加入FicollPaque分离液，采纳密度梯度离心法分离单个核细胞，以3×

105的密度接种于铺有Fn的培育瓶中，培育液用EGM2。

培育至7d左右行DilacLDL和FITCUEAI双染色，记数双阳性细胞为EPCs。

EPCs的干与

培育细胞分为对照组、超声组和超声微泡组3组。

实验前将培育的EPCs用胰酶消化制成单细胞悬液，摇匀后以100μl（约5×

105ml-1）加入96孔培育板。

对照组不做干与，超声组以频率1MHz、输出功率W·

cm-2持续辐照90s；

超声微泡组加入5μl微泡（约2×

108ml-1），以一样超声条件作用90s。

96孔培育板固定在37℃双蒸水水槽表面，超声探头垂直置于培育板下方约8cm处，为幸免超声波对临近孔细胞的阻碍，隔孔接种细胞，每组8孔。

CCK8测定细胞增殖活性

当孔内细胞生长至60%～70%融合时,无血清培育24h，以、、、、、W·

cm-2的不同声强超声联合微泡干与EPCs，继续培育24h后每孔加入CCK8溶液10μl，37℃孵育1～2h，酶标仪上以450nm测吸光度，细胞增殖越多、越快，那么颜色越深，呈线性关系。

流式细胞仪检测坏死凋亡细胞及细胞周期

各组细胞干与后继续培育24h，搜集细胞用1ml冷PBS制成1×

105ml-1的细胞悬液,1000r·

min-1离心10min，弃上清,将细胞重悬于200μl结合缓冲液中,加入PI液5μl，混匀避光室温反映15min，再加入300μl结合缓冲液,流式细胞仪以激发波长488nm检测，结果输入运算机，直接给出凋亡及坏死细胞百分比，同时取得DNA含量散布结果。

统计学处置

采纳SPSS统计软件包进行数据分析，所有数据用x-±

s表示，组间比较采纳单因素方差分析（OneWayANOVA），组间两两比较采纳StudentNewmanKeuls（SNK）查验，P&

lt;

表示不同有统计学意义。

2结果

2．1EPCs的鉴定结果

培育第7天贴壁细胞形态以梭形为主，可见圆形及不规那么形细胞。

荧光显微镜下，细胞摄取DiIacLDL后呈红色，FITCUEAI染色后呈绿色，双染色细胞中EPCs占90％以上（图1）。

2．2超声联合微泡作用对EPCs增殖活性的阻碍

、、、、和W·

cm-2不同声强超声微泡组的吸光度值别离为±

、±

和±

（图2）。

与对照组（±

）相较，、、和W·

cm-2组对EPCs增殖活性无阻碍（P=），和W·

cm-2组EPCs增殖活性明显下降（P﹤）。

可见超声联合微泡作用对EPCs增殖活性无阻碍的最大超声能量是W·

cm-2，能够在取得最大生物效应同时平安用于实验研究。

图2不同声强超声联合微泡作用下的吸光度（CCK8法）超声联合微泡对EPCs凋亡坏死的阻碍

为了进一步研究W·

cm-2声强超声联合微泡对EPCs的阻碍，用PI染色流式细胞仪分析细胞凋亡坏死情形。

检测结果显示对照组为±

%、超声组为±

%，两组相较有统计学不同（P&

）；

超声微泡组为（±

）％，与对照组相较无统计学不同（P=）。

超声联合微泡对EPCs细胞周期的阻碍

用流式细胞仪进行细胞周期分析说明，W·

cm-2声强超声作用下处于S期的EPCs比例为（±

）％，较对照组（±

）％明显减少，有显著统计学不同（P&

而超声微泡组为（±

）％，较对照组反而有轻度增加，但无统计学不同（P=）。

见表1。

表1对照组、超声组与超声微泡组不同细胞周期EPCs

3讨论

缺血性心脏病已成为不同收入国家人口死亡的首要缘故，别离占到低中收入和高收入国家患病人口的％和％［1］。

而干细胞移植以替代、修复或改善受损心肌组织的生物学功能，显示出良好的临床应用前景，但仍存在移植效率低、心功能改善不确信等问题［2］。

超声微泡作为超声增强造影剂，除用于临床诊断外，目前已用于医治相关研究。

已有实验证明超声介导毛细血管内微泡破裂可增进正常或缺血大鼠后肢局部动脉生成，灌注血流增加，踏车时刻延长［35］；

同时内皮细胞渗透性及细胞间隙增加，有利于基因、药物和细胞靶向渗入组织［6］。

因此咱们假设超声破坏微泡联合冠脉内移植EPCs医治心肌梗死，能够增进心肌内归巢，增强血管生成，增加局部血流灌注，从而进一步改善心功能。

本实验在体外研究超声联合微泡增效EPCs医治的可行性和平安性。

实验结果提示，低声强（～W·

cm-2）超声作用下微泡对EPCs增殖活性无阻碍；

高声强（﹥W·

cm-2）作用下，随声强慢慢增大，EPCs增殖活性慢慢降低。

为了在体内实验中取得最大生物学效应，如促血管生成、增加血管壁通透性等，咱们选择W·

cm-2声强作为超声实验值，进一步研究其对EPCs凋亡坏死及细胞周期的阻碍。

结果说明:

与对照组比较，超声联合微泡对EPCs凋亡坏死及细胞周期无明显阻碍，相反超声组明显增加EPCs凋亡坏死，同时显著抑制EPCs的DNA合成。

值得注意的是，W·

cm-2单纯超声抑制EPCs增殖，增加细胞凋亡和坏死，而联合微泡作历时对其没有明显阻碍。

这与超声干与肿瘤细胞的结果大体一致：

Feril等［7］应用频率1MHz的超声、W·

cm-2）辐照U937肿瘤细胞，持续10min，观看到两组细胞凋亡都增加。

目前以为，上述作用可能与超声的机械作用、热效应和空化效应有关。

低强度超声被组织吸收后产生少量热能，增强酶的活性，增进细胞代谢。

而较高剂量超声使组织细胞过热致使酶活性破坏，抑制细胞代谢。

另外，较高强度超声通过刹时空化效应使细胞膜、DNA和其他细胞结构损伤,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。

当有微泡造影剂存在的时候，超声作用下振动微泡周围可产生剪切力，对临近细胞发挥生物学效应［8］。

已有实验说明，剪切力作用下增进EPCs增殖、分化，eNOSmRNA表达和NO生成增加，同时增强Cu/ZnSOD活性［911］。

以上作用可能部份排除单纯超声对EPCs的不良作用，但详细机制还需进一步的实验证明。

综上所述，W·

cm-2声强的超声联合微泡作用在取得最大生物效应的同时，对EPCs的增殖活性、细胞凋亡坏死及细胞周期无明显不良阻碍，为进一步体内研究超声联合微泡增效EPCs移植的可行性和平安性提供了依据，从而使超声微泡辅助的干细胞移植有可能从改善移植细胞归巢入手，成为医治缺血性心脏病一种新的有效方式。

【参考文献】

［1］ALANDL，COLIINDM，MAJIDE，etandregionalburdenofdiseaseandriskfactors，2001:

systematicanalysisofpopulationhealthdata［J］.Lancet,2006,367:

17471757.

［2］VINCENTFMS，RICHARDTcelltherapyforcardiacdisease［J］.Nature,2020,451:

937942.

［3］JIS，MINGQ，SANJIVK，etofarteriogenesisinskeletalmusclebymicrobubbledestructionwithultrasound［J］.Circulation,2002,106:

15501555.

［4］SONGJI，PATRICKSC，ALEXANDERL，etremodelingandacceleratedhyperemiabloodflowrestorationinarteriallyoccludedskeletalmuscleexposedtoultrasonicmicrobubbledestruction［J］.AmJPhysiolHeartCircPhysiol,2004,287（6）:

H27542761.

［5］JUNJIY，KOJIO，HIROTOT，etofischemiclimbsbasedonlocalrecruitmentofvascularendothelialgrowthfactorproducinginflammatorycellswithultrasonicmicrobubbledestruction［J］.JAmCollCardiol,2005,46:

899905.

［6］SOPHIEH，ALEXANDERL，KLIBANOVinultrasoundtriggereddrugandgenedelivery［J］.AdvancedDrugDeliveryReviews,2020,60:

11531166.

［7］FERILLB，KONDOT，ZHAOQL，etofhyperthermialinducedapoptosisbynonthermaleffectsofultrasound［J］.CancerLett,2002,178

（1）:

6370.

［8］BORISK，EITANstressinducedbyag