成纤维细胞生长因子21的代谢活动需要βKlotho文档格式.docx
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FGF23主要由骨组
织分泌并作用于肾脏从而抑制磷酸盐的重吸收和维生素D的生物合成。
FGF15由肠粘膜上
皮表达并参与肝脏中胆汁酸合成的负反馈调节。
FGF21最主要的表达部位在肝脏，且已经在一项针对具有治疗糖尿病潜力的新因子的研究中显现出了作为脂肪细胞摄取葡萄糖的代谢性调节剂的作用。
事实上，无论是给肥胖的小鼠还是已经患有糖尿病的小鼠使用重组FGF21，都能降低其血糖水平。
此外，过度表达FGF21的转基因小鼠表现为低血糖，对胰岛素敏感以及能够抵抗由饮食诱导的肥胖。
FGF21可以活化FGF受体（FGFRs）并向下游分子传递信号，包括脂肪细胞中的FGFR
底物2a（FRS2a）以及44/42MAP激酶（ERK1/2）。
然而，旨于论证FGF受体与FGF21之间的直接相互作用关系的试验都以失败告终。
另外，包括3T3-L1前成脂肪细胞在内的许
多种非脂肪细胞的细胞类型，尽管它们表达多种亚型的FGF受体，但对FGF21却没有反应。
此外，过度表达FGF受体的BaF3细胞需要高于药理学剂量的FGF21（200-800nM）才能产
生可检测到的促有丝分裂作用。
这些观察结论说明，在脂肪细胞中，FGF21可能需要辅助
Klotho，一种单次跨膜蛋白质，在FGF23活化的FGF23信号Klotho最初是作为一种基因突变在显现出与人
Klotho蛋白的小鼠与Klotho和FGF23可能是Klotho蛋白与FGF在本次试
因子来完成FGF信号传递的激活。
我们同其他人一起鉴定了
传递过程中是一个起关键作用的辅助因子。
类过早老化综合征相似表型的Klotho小鼠中得以被识别。
通过对缺乏敲除FGF23基因的小鼠的观察，发现了较多的表型重叠，这说明，通过共同的信号转到通路实现作用。
确实，在许多种人工培养的细胞中，
Klotho，在FGF21的信号传出中起
受体相互锚定并在FGF23结合FGF受体及激活FGF信号传出中发挥必要的作用。
验中，我们的目的是展示作为Klotho蛋白家族一员的B
着辅助因子的作用。
FGF23都不能在亲代的293细胞中缺乏感应这一现象所证实（图1）。
结果和讨论
FGF21需要Klotho来激活FGF的信号传递。
FGF21和
传递信号这一事实已经由其对磷酸化的FRS2和ERK1/2
我们之前曾报道过异位的过度表达的Klotho可以引起293细胞对FGF23的反应。
然而，这
些过度表达Klotho的细胞并不对FGF21的刺激产生反应。
相比之下，表达相关pKlotho蛋
白的293细胞获得了对FGF21刺激的反应能力（图1）。
我们发现，Klotho蛋白通过与FGF23及FGF受体形成三元复合体来促进FGF23的信号传递。
因此，我们检测了是否在FGF21
的信号传递中，Klotho也是通过形成三元复合体而发挥类似的作用。
pFRS2tt
pERKl；
2
ERK1I/2
PKIotho
抗体，pKlotho抗体或pKlotho抗体进行免疫印迹试验。
pKlotho与多种FGF受体结合。
哺乳动物的FGF受体由四种不同的基因编码
（FGFR1-FGFR4）。
典型的FGF受体的胞外域由三种免疫球蛋白样的区域组成（D1-D3）。
FGFR1-3中D3可以经由一种主要替代性mRNA剪接事件产生“b”和“c”两种亚型，这两种亚型可分别结合不同的FGF。
另一种额外的剪接活动可以产生缺乏D1和/或D1-D2衔
接物的较短的FGFR1-3亚型。
我们简要描述了不同的FGF受体亚型（见图2）和293细胞
的pKlotho及其共免疫沉淀反应试验。
如图2所示，FGFR1C和FGFR4可以比其他FGF受
体更有效的使pKlotho发生沉淀。
相比之下，FGFRb亚型并没能在试验条件下使pKlotho
Klotho蛋白。
沉淀。
pKlotho与FGFR1C亚型以及FGFR4的结合优势使人联想到
图2：
pKlotho可与多种FGF受体结合。
转染了p定簇标记的FGF受体亚型与抗V5抗体共同温育,
FGF受体的出现（中间）进行分析。
用于免疫沉淀（
于此次试验的FGF受体亚型方案已在结果项的上面给出。
第三个免疫球蛋白样结构域（D3）的C末端，在图中分别以阴影条和黑色条表示。
另一个选择性的剪接事
件发生在第一个免疫球蛋白样结构域（D1）和“acidicbox”之中，产生了FGFR1和FGFR2的长（L）、中
（M）、短（S）亚型。
每一个细胞溶解产物样本中的一部分都在经过处理后与抗pKlotho抗体进行了免疫
印迹试验，从而确认在这些细胞样本中pKlotho表达的一致性。
同pKlotho与FGFRIc和4强烈相互作用相一致的是，pKlotho-FGFRIc以及pKlotho-FGFR4复合体都能够比单独的FGFR和其他种类的pKlotho-GFGR复合物更有效的
使FGF21发生沉淀，这些都说明，FGF21与其同源受体的稳定结合需要pKlotho的参与（图
3）。
ip
FGFR（V5）
flKloCho
■
+
FGFR
11c
L
1c2
5I
c2c2
Ic1
Lf
c2c2
5Lh
q
1g
卩Klotho
FGF21
CV5）
■■.■
■•■
（iceliIysole）
图3
FGFR或联合转染了FGFR与pKlotho的
FGFR或pKlotho-FGFR复合物发生免疫沉
图3:
FGF21优先与pKlotho-FGFR复合物结合。
将单独转染了
293细胞溶解，载有抗V5抗体的琼脂糖小球使细胞溶解物中的
淀。
随后将琼脂糖珠同经过调配的包含FGF21的培养液共同温育，在生成琼脂糖小球蛋白复合物之后，根
据pKlotho或FGF21或FGF受体的出现进行免疫印迹分析试验。
每一个细胞的溶解产物样本中的一部分
都在经过处理后与抗pKlotho抗体进行了免疫印迹分析试验，从而确认在这些细胞样本中pKlotho表达的
一致性。
脂肪细胞中FGF21的作用取决于pKlotho的表达。
鉴于FGF21只能刺激分化型脂肪细胞的葡萄糖摄取而对前成脂肪细胞没有刺激作用，我们推断是由分化型的脂肪细胞表达p
Klotho，而不是前成脂肪细胞。
确实，我们没能在前成脂肪细胞中检测到pKlotho的表达，
此外，FGF21也无法在这些前成脂肪细胞中引出信号传递。
然而，分化型的脂肪细胞可以大量表达pKlotho并对FGF21的刺激产生强烈反应（图4A）。
为了进一步证实FGF21的作用对pKlotho的依赖性，我们在前成脂肪细胞分化为脂肪细胞的过程中，持续监测pKlotho
的表达。
最早在第四天即可检测到pKlotho的表达并持续增加直到第十天。
这种短暂的p
Klotho表达增加与FGF21诱导FRS2a和ERK1/2磷酸化的能力相关（图4B）。
我们同样研究了FGF21诱导的FRS2a和ERK1/2磷酸化的时间和剂量反应性。
如图4C所示，FRS2a
和ERK1/2分别在3分钟和5分钟时出现明显的磷酸化，并在细胞接受刺激之后约60分钟
时开始下降。
FGF21信号传导通路的活化在FGF21浓度为10ng/ml（0.3nM）时始可被检测
到，在浓度为1000ng/ml（30nM）时达到饱和。
最后，我们展示了在分化型的脂肪细胞中，内源性的pKlotho可以使内源性的FGFR1C发生沉淀（图4D）,这表明在生理条件下，pKlotho会同FGFR1C生成复合物。
負Preodipoc/KJsAdi'
poo^tca
图4
3T3-L1脂肪细胞中，FGF21
图4:
表达pKlotho的脂肪细胞可以对FGF21的刺激发生反应。
（A）在分化型的
可活化FRS2a和ERK1/2。
以经过调配的含有鼠FGF21或鼠FGF23的培养液刺激3T3-L1前成脂肪细胞和分化型脂肪细胞。
以同等剂量的提取自经过模拟载体转染的293细胞的培养液作为阴性对照（对照组）。
以
重组FGF21（100ng/ml）作为阳性对照。
（B）3Klotho表达于由前成脂肪细胞向脂肪细胞分化的过程中。
诱导3T3-1L前成脂肪细胞分化，在分化经过如图中所示的天数后，以含有FGF21的调制培养液刺激这些
细胞10分钟。
细胞溶解产物经过处理后同图中所示抗体分别进行免疫印迹分析实验。
（C）FGF21介导的
3T3-L1脂肪细胞信号传导的剂量依赖性和时程。
以递增剂量的重组人FGF21刺激分化型3T3-L1脂肪细胞
10分钟（左）或以1卩g/ml的重组人FGF21按不同时长刺激分化型3T3-L1脂肪细胞（右）。
相应的细胞溶解产物以如图所示的抗体进行免疫印迹分析实验。
（D）脂肪细胞中，内源性3Klotho与FGFR1C形
成复合物。
3T3-L1脂肪细胞的溶胞产物同抗FGFR1抗体或正常IgG进行免疫沉淀反应（i.p.），
随后与抗3Klotho抗体或抗FGFR1抗体进行免疫印迹分析试验（i.b.）。
经过预处理的分化型3T3-L1脂肪细胞（上部，代表输入量的5%）或转染了FGFR1C（L）和FGFR1C（S）的
293细胞（下部，作为这些受体的大小标准参照物）的溶胞产物分别被直接用于免疫印迹分
析从而证实3Klotho和FGFR1C的存在。
为了提供更强有力的证据证明FGF21信号传递对3Klotho的依赖性，我们使用siRNA
敲除了分化型脂肪细胞中的3Klotho表达。
分别针对3Klotho基因中不同序列的四种不同
的siRNA都可以抑制FGF21对FRS2a和ERK1/2的活化作用（图5A），更重要的是，可以使FGF21失去促进葡萄糖摄取的作用，这表明3Klotho在FGF21发挥其对脂肪细胞的代谢
性作用时起着关键性的作用（图5B）
FGF21诱导的脂肪细胞摄取葡萄糖伴随着葡萄糖转运体1（GLUT1）的上调，已知
GL
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