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起止日期：

20**年*月至20**年8月

2016年10月

研究生个人简介

目录

缩略词表1

中文摘要2

Abstract3

前言4

材料和方法5

1材料5

2方法5

结果6

讨论7

结论8

参考文献9

综述10

攻读硕士学位期间发表学术论文11

临床培训小结12

致谢13

论文独创性声明14

论文使用授权声明14

论文审阅认定书15

缩略词表

Abbreviation

缩略词

英文全称

中文全称

BrdU

5-bromo-2’-deoxyuridine

5-溴脱氧尿核苷

BDNF

Brain-derivedneurotrophicfactor

脑源性神经营养因子

COD

Correctedopiticaldensity

校正吸光度

CNS

Centralnervoussystem

中枢神经系统

DAB

Diaminobenzidine

3,3-二氨基联苯胺

DG

Dentategyrus

齿状回

GCL

Granulecelllayer

颗粒细胞层

GFAP

Glialfibrillaryacidicprotein

胶质原纤维酸性蛋白

i.p.

Introperitioneal

腹腔内注射

IGF-I

Insulin-likegrowthfactor-I

胰岛素样生长因子

KA

Kainicacid

红藻氨酸（海人酸）

LTP

Long-termpotentiation

长时程增强

MK-801

5-methyl-10,11-dihydro

5-甲基二氢二苯并环

-5H-dibenzocyclohepten-

庚烯亚胺马来酸

神经发生和突触重塑的研究

中文摘要

目的目前，对癫痫反复发作的病因的说法很多，但齿状回颗粒细胞的神经发生增加，颗粒细胞的苔藓纤维异常发芽及伴随的突触重塑已被认为是其细胞机制之一。

故近年有关神经发生和突触重塑的研究正成为脑科学中令人瞩目的热点，但是这些现象对临床上常见的儿童癫痫反复发作的病因是否有作用，目前还少有报道。

方法腹腔注射戊四氮制作发育期SD大鼠（7天、14天、21天和28天四个日龄组）癫痫持续状态（SE）发作模型，再将各日龄组随机分为NS组、SE组和MK-801组，选择处理后第7天、14天和28天三个时间点进行观察。

结果BrdU免疫反应产物：

SE发作后第7天和14天，SE组中各日龄组幼鼠齿状回BrdU阳性细胞数明显高于各自的NS组（P＜0.01），而MK-801组较SE组明显减少（P＜0.05），但在第28天三组之间无明显差异（P＞0.05）；

发作后第7天，三组中大部分BrdU阳性细胞分布于颗粒下层。

结论1.癫痫持续状态发作可使不同日龄的发育鼠脑内齿状回神经元发生数量的增加、位置的迁移和异位以及突触的重塑。

2.NMDA受体在癫痫后的神经元发生和突触重塑中起着促进作用。

关键词发育鼠,癫痫持续状态,突触素,海马,BrdU,MK-801

Thestudyofneurogenesisandsynapticplasticityinhippocampusfollowingpentylenetetrazol-inducedstatusepilepticusofdevelopingrats

Abstract

ObjectiveRecentlydentategranulecellneurogenesisinhippocampusand

mossyfiberabnormalsproutingandsynapticreorganizationhavebeenidentifiedasoneofcellmechanismofrecurrentattacksofepilepsy.Thustheresearchofneurogenesisandsynapticreorganizationhasbeenoneofhotspotsinadultbrainstudy.Buttherewaslittledataofepilepsymechanismonchildrenwithrecurrentepilepsyfrequentlyinclinic.

MethodsPostnatalday（P）P7,P14,P21andP28SpragueDawley（SD）ratswerereceivedPTZtomakestatusepilepticusmodels,whichweredividedrandomlyintoSEgroup,wesubjectedMK-801toratsafterPTZandobservedthechangesofthemabove.

Results1.BrdUimmunohischemistry:

QuantitativeanalysisofBrdUlabelingrevealedasignificantincreaseintheproliferationrateofneuralprecursorcellsinthedentategyrus7daysand14daysafterSE.Buton28daysafterSEtherewasnodifferenceamongthreegroups（P＞0.05）.

ConclusionSEmayinducetheneurogenesisandsynapticplasticityinhippoca-

mpusindevelopingbrain.Intheprocessofneurogenesis,thereisanincreaseinnumberandmigrationinlocation.AndNMDAreceptorplaysanimportantroleintheneurogenesisofhippocampusandsynapticplasticityafterseizures.

Keywordsdevelopingrats;

statusepilepticus;

neurogenesis;

synaptophysin;

hippocampus;

MK-801

前言

癫痫（Epilepsy）是最常见的神经系统疾病之一，是由于脑细胞突然异常放电所引起的反复性惊厥发作。

近年来由于环境和心理因素癫痫的发病率有逐年增高的趋势，据统计我国每年新发癫痫在40万例左右，其中高发区每年每十万人口新发病例60例左右，而儿童癫痫发病率比成人高出1～4倍，尤以出生后1岁内发病率最高[1]。

因此对儿童癫痫的发病机制和治疗的研究越来越受到重视，但对于癫痫机制研究的思路和设想目前大多来源于对癫痫病灶的病理和生化活动的详细观察。

由于癫痫病灶最常见的病理变化（以海马区为例）是神经元变性、凋亡和坏死，未死亡神经元树突分布范围的缩小和突触棘的消失，胶质细胞的增生以及海马颗粒细胞的轴突发芽等。

因此，大多数癫痫的机制假说均以此为依据。

目前，对癫痫反复发作的病因的说法很多，但齿状回颗粒细胞的神经发生增加、颗粒细胞的苔藓纤维异常发芽及伴随的突触重塑已被认为是其可能的细胞机制之一。

过去研究认为，哺乳类中枢神经系统的神经发生主要限于胚胎期，而且认为出生后将不再存在神经发生现象。

但近来研究发现，脊椎动物中枢神经系统很多区域包括海马齿状回在生后乃至成年的整个发育期仍然保持着神经发生的能力，并在某些生理刺激和病理因素作用下，这些部位的神经发生表现出明显的增强趋势[2,3]，从而使人们对神经元再生的认识产生了根本性改变，并揭开了中枢神经系统神经再生在不同病理状态下如何发挥作用的新研究。

另外，神经系统受损后现存的神经元可通过轴突出芽形成不同的径路与原有的突触后位点或新的突触后位点发生接触,形成新的突触；

同时，平时处于休眠状态的侧支和突触联系在病理状态下被激活，从而完成神经回路的改造和突触的重塑。

材料和方法

1材料

1.1试剂

戊四氮Sigma公司

BrdUSigma公司

抗体稀释液北京中山生物技术有限公司

Triton-x100华美生物工程公司

1.2仪器

FA1004型电子天平上海天平仪器厂

OlymphusPM-CB日本奥林巴斯公司

KD1508轮转式切片机浙江金华科迪设备有限公司

S2-93自动双重纯水蒸馏器上海亚莱生化仪器厂

各种微量加样仪芬兰Labsystem公司

2方法

2.1研究对象选择健康SpragueDawley（SD）大鼠出生后第7天、14天、21天和28天（Postnatal,P7,P14,P21,P28）四个日龄组，雌雄不限，同一日龄组内体重相近，各组均为54只，共计216只，由**医学院实验动物中心提供。

将大鼠再随机分为癫痫持续状态组（SE组）、MK-801治疗组（MK-801组）和正常对照组（NS组），每组各6只。

结果

1动物模型行为表现

SE组和MK-801组：

注射PTZ后经过1～2分钟的潜伏期，大鼠由自由活动状态逐渐转为安静或俯卧，随后出现眼神呆滞，头面部肌肉轻微抽搐，伴有须动、耳抖和搔抓动作，继而进入大发作期，渐次出现前肢阵挛、狂奔、跳跃、嘶叫、后肢站立伴头偏向一侧及全身阵发性抽动；

达到7级发作的动物则表现为摔倒、翻滚等全身强直-阵挛性发作，同时伴有喉鸣、口角流涎、肢端青紫等。

整个发作持续为1小时后经注射安定后逐渐缓解，发作停止后，动物可自由活动。

NS组：

注射NS后无任何发作迹象和抽搐表现，行为正常。

2BrdU免疫反应产物

SE发作后第7天和14天，SE组各日龄组幼鼠齿状回BrdU阳性细胞数明显高于各自的NS组，同时MK-801组较SE组明显减少（P＜0.05），但在第28天时三组之间无明显差异（P＞0.05）（见表1和图2～5）。

SE发作后第7天，三组幼鼠的大部分BrdU阳性细胞分布于颗粒下层（见图1A），发作后第14天，新生细胞在SE组和MK-801组幼鼠中除主要分布于颗粒细胞层以外，另有一部分位于门区和内分子层（图1B），而在NS组幼鼠的BrdU阳性细胞主要分布于整个颗粒细胞层（见图1C）。

新生细胞在由颗粒下层向颗粒细胞层迁移的过程中，胞核变大，形状更接近圆形或卵圆形（见图1D）。

阴性对照试验切片无特征性免疫反应产物。

讨论

本实验中对发育鼠年龄的选择是基于人脑和大鼠脑发育程度的对应关系。

虽然大鼠脑发育与人脑发育的年龄对应关系目前还不十分清楚，但普遍接受的观点认为，生后5～7d大鼠的脑发育程度与足月新生儿的脑发育程度相当，15d大鼠的脑发育程度与1岁儿童相当，28～30d大鼠的脑发育程度与2岁儿童相当[6]，大鼠于生后50d左右进入青春期，生后60d性成熟。

由于儿童癫痫发病率比成人