柱层析介绍PPT格式课件下载.ppt

柱层析介绍PPT格式课件下载.ppt

《柱层析介绍PPT格式课件下载.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《柱层析介绍PPT格式课件下载.ppt（28页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

（三）（三）层析的分类层析的分类1、按操作形式、按操作形式：

柱层析柱层析：

将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离；

纸层析纸层析：

用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的；

薄层层析：

将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定；

2、根据移动相种类的不同、根据移动相种类的不同：

气固层析（GSC）液液层析（LLC）气相层析液相层析气液层析（GLC）液固层析（LSC）3、按层析的机理：

、按层析的机理：

吸附层析：

利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离鉴定的目的；

分配层析：

利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同，使之分离；

离子交换层析：

利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同；

凝胶层析：

利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。

以上划分无严格界限，有些名称相互交叉，如亲和层析应属于一种特殊的吸附层析，纸层析是一种分配层析，柱层析可做各种层析。

二、柱层析的基本操作柱色谱一般有吸附色谱和分配色谱两种。

前者常用氧化铝和硅胶作固定相，在分配柱色谱中以硅胶、硅藻土和纤维素作为支持剂，以吸收一定量的液体作固定相，而支持剂本身不起分离作用。

实验室中最常用的是吸附色谱。

根据混合物中各组分对吸附剂（即固定相）的吸附能力，以及对洗脱剂（即流动相）的溶解度不同将各组分分离。

（一）

（一）原理原理层析柱分离物质的示意图层析柱分离物质的示意图固定相为固体颗粒，装在层析柱内，高5cm，固定相周围充满液体流动相，每厘米柱中液相体积为1cm3。

若在柱顶加入1cm3溶剂,其中含32mg样品，同时应有相同体积的溶剂从柱底流出，此时样品处于柱中A位置。

若样品的分配系数是1，则它在固相与液相间等量分配。

若再有1cm3的溶剂加到柱上，A部分中的溶剂带着16mg的物质向下移动到B，A和B中的物质都将发生再分配AABCDE3216168168441212228128不同物质分配系数不同时不同物质分配系数不同时不不同同组组分分的的含含量量不同组分在柱中的位置不同组分在柱中的位置上部上部中部中部下部下部（二二）几个基本概念几个基本概念如上图有：

VtVoViVg，由于Vg相对很小，可以忽略不计，则有：

VtVoVi。

外水体积外水体积是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积。

内水体积内水体积是指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体积。

基质体积基质体积是指凝胶颗粒实际骨架体积。

而柱床体积柱床体积就是指凝胶柱所能容纳的总体积。

洗脱体积洗脱体积是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。

（三）基本操作步骤（三）基本操作步骤装柱加样洗脱和分离收集各组分鉴定与检测11、装柱、装柱色谱柱的大小规格由待分离样品的量和吸附难易程度来决定。

一般柱管的直径为0.5-10cm，长度为直径的10-40倍。

填充吸附剂的量约为样品重量的20-50倍，柱体高度应占柱管高度的3/4。

柱子过于细长或过于粗短都不好。

装柱前，柱子应干净、干燥，并垂直固定在铁架台上。

将少量洗脱剂注入柱内，取一小团玻璃毛或脱脂棉用溶剂润湿后塞入管中，用一长玻璃棒轻轻送到底部，适当捣压赶出棉团中的气泡，但不能压得太紧，以免阻碍溶剂畅流（如管子带有筛板，则可省略该步操作）。

再在上面加入一层约0.5cm厚的洁净细砂，轻扣击柱管，使砂面平整。

常用的装柱方法有干装法和湿装法两种

（1）干装法在柱内装入2/3溶剂，在管口上放一漏斗，打开活塞让溶剂慢慢地滴入锥形瓶中，接着把干吸附剂经漏斗以细流状倾泻到管柱内，同时用套在玻璃棒（或铅笔等）上的橡皮塞轻轻敲击管柱，使吸附剂均匀地向下沉降到底部。

填充完毕后，用滴管吸取少量溶剂把粘附在管壁上的吸附剂颗粒冲入柱内，继续敲击管子直到柱体不再下沉为止。

柱面上再加盖一薄层洁净细砂，把柱面上液层高度降0.11cm，再把收集的溶剂反复循环通过柱体几次，便可得到沉降得较紧密的柱体。

（2）湿装法基本方法与干装法类似，所不同的是，装柱前吸附剂需要预先用溶剂调成淤浆状，在倒入淤浆时，应尽可能连续均匀地一次完成。

如果柱子较大，应事先将吸附剂泡在一定量的溶剂中，并充分搅拌后过夜（排除气泡），然后再装。

其优点是一般柱子装的比较结实，没有气泡。

无论是干装法，还是湿装法，装好的色谱柱应是充填均匀，松紧适宜一致，没有气泡和裂缝，否则会造成洗脱剂流动不规则而形成“沟流”，引起色谱带变形，影响分离效果。

22加样加样上样也有干法和湿法之分：

干法就是把待分离的样品用少量溶剂溶解后，在加入少量硅胶，拌匀后再旋去溶剂。

如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层。

干法上样较麻烦，但可以保证样品层很平整。

湿法上样就是用少量溶剂（最好就是展开剂，如果展开剂的溶解度不好，则可以用一极性较大的溶剂，但必须少量）将样品溶解后，再用胶头滴管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁均匀加入。

加完后，用少量溶剂把容器和滴管冲洗净并全部加到柱内，再用溶剂把粘附在管壁上的样品溶液淋洗下去。

慢慢打开活塞，调整液面和柱面相平为止，关好活塞。

如果样品是液体，可直接加样。

33洗脱与检测洗脱与检测在洗脱过程中，柱内不断地发生解吸、吸附，再解吸、再吸附的过程。

当我们选定好洗脱液后，洗脱的方式可分为简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱三种。

简单洗脱简单洗脱：

柱子始终用同样的一种溶剂洗脱，直到层析分离过程结束为止。

如果被分离物质对固定相的亲合力差异不大，其区带的洗脱时间间隔（或洗脱体积间隔）也不长，采用这种方法是适宜的。

但选择的溶剂必须很合适方能使各组分的分配系数较大。

否则应采用下面的方法。

分步洗脱分步洗脱：

这种方法按照递增洗脱能力顺序排列的几种洗脱液，进行逐级洗脱。

它主要对混合物组成简单、各组分性质差异较大或需快速分离时适用。

每次用一种洗脱液将其中一种组分快速洗脱下来。

梯度洗脱梯度洗脱：

当混合物中组分复杂且性质差异较小时，一般采用梯度洗脱。

它的洗脱能力是逐步连续增加的，梯度可以指浓度、极性、离子强度或pH值等。

最常用的是浓度梯度。

对洗脱液接收时，有色物质，按色带进行收集，但色带之间两组分会有重叠。

对无色物质的接收，一般采用分等份连续收集，每份流出液的体积毫升数等于吸附剂的克数。

若洗脱剂的极性较强，或者各成分结构很相似时，每份收集量就要少一些，具体数额的确定，要通过薄层色谱检测，视分离情况而定。

现在，多数用分步接收器自动控制接收。

洗脱完毕，采用薄层色谱法对各收集液进行鉴定，或紫外光检测，以洗脱液体积对被洗脱物质浓度作图，可得到洗脱曲线把含相同组分的收集液合并，除去溶剂，便得到各组分的较纯样品。

（四）（四）硅胶柱、大孔吸附树脂柱、聚酰胺柱硅胶柱、大孔吸附树脂柱、聚酰胺柱11、硅胶柱、硅胶柱.装柱装柱活化硅胶：

活化硅胶：

100100110110OOC,0.5hC,0.5h；

层析主经长比：

11：

20203030；

样品与吸附剂比例：

30306060；

沉降平衡。

.上样上样干法：

样品难溶于洗脱剂时，用少量适当溶剂拌适量硅胶溶解、挥干，上柱；

干法：

湿法：

样品溶于洗脱剂时湿法：

样品溶于洗脱剂时。

.洗脱：

洗脱：

溶剂选择见下（洗脱剂的选择）溶剂选择见下（洗脱剂的选择）.常压与加压：

常压与加压：

硅胶粒度细时，为了保证洗脱速度可以适当加压。

2.2.大孔吸附树脂柱大孔吸附树脂柱大孔吸附树脂是一种具有大空结构的有机高分子共聚体，是一类人工合成的有机高聚物吸附剂，因其具有多孔性结构而具有筛选性，又通过表面吸附、表面电性或形成氢键而具有吸附性。

一般粒度2060目，分为非极性、中级性、极性、强极性。

采用大孔吸附树脂分离纯化中药的有效成分，应根据欲处理成分的理化性质考虑以下因素：

适合的树脂、树脂预处理、吸附溶质的浓度、吸附流速与温度、解吸附剂种类、解吸附时流速与温度等。

.树脂前处理树脂前处理新购树脂中可能含有未聚合的单体、分散剂、致孔剂、引发剂、惰性溶剂等化学残留，所以使用前必须进行预处理以保证最后药用安全。

一般方法：

乙醇浸泡24h，连续加热回流数次（更换新溶剂）后湿法上柱，用乙醇洗脱至流出液与水（1:

2）混合不产生浑浊，再用水冲至无醇味，水浸泡备用。

注意不同型号树脂处理方法不同，请按照厂商提供方法处理。

.装柱与上样装柱与上样方法同前，亦有干法湿法。

上样液最好澄清，故上样前影进行一定的处理，如预先沉淀、滤过处理、PH处理、使部分杂质在处理过程中除去，以免堵塞树脂床或在洗脱时混入洗脱液中。

.洗脱洗脱化合物经树脂吸附之后，在树脂表面或内部还残留许多非极性或水溶性较大的强极性杂志成分，一般用水洗去。

为避免损失影同步检测，然后再用解吸附剂洗脱。

注意若解吸附剂中有机部分浓度较高，应采用梯度洗脱，逐步增大浓度，否则，树脂床中易产生大量气泡而影响洗脱。

注：

.解析条件的确定要考虑解析条件的确定要考虑：

解析剂（解吸附曲线，尖锐不拖尾）；

解析剂的PH；

解析速度（脱附曲线，流速慢，脱附效果好，但周期长）；

解析温度（一般升温有利于脱附，但可能使杂质混入洗脱液）。

.影响上样吸附的因素影响上样吸附的因素层析主选用不当（:

L）；

装柱不当（送进均匀、顶端平整）；

药液处理不当（前处理、反洗、黏性）；

上样流速控制不当（快-吸附不完全，慢-效率低）；

树脂型号选用不当（动态吸附、静态吸附）。

3.3.聚酰胺柱聚酰胺柱v聚酰胺是通过酰胺键聚合的一类高分子化合物，对碱较稳定而对酸不稳定，其酰胺键可以与酚类、酸类、醌类和硝基化合物等形成氢键而被吸附，从而与不能形成氢键的化合物分离。

聚酰胺具有”双重色谱”的性能：

正向和反向分配色谱。

常用于分离酚类、黄酮类、醌类以及脱鞣处理等。

v聚酰胺使用前必须预处理：

过筛，再以90-95%乙醇浸泡，不断搅拌，除去气泡后装入柱中。

用3-4BV的90-95%乙醇洗脱，洗至洗脱液透明并在蒸干后无残渣（或极少残渣）。

再依次用2-2.5BV的5%NaOH水溶液、1BV的蒸馏水、2-2.5BV的10%醋酸水溶液洗脱，最后用蒸馏水洗脱至pH中性，备用。

v装柱加样：

同大空树脂。

上样量约1.52.5g/100ml，上样药液浓度20%30%v洗脱：

先用水洗，再用醇洗，醇浓度递增，直至无水乙醇或甲醇，若仍有物质未被洗脱，可以用稀氨水或甲酰胺洗脱，分段收集。

三、柱层析常见问题与对策三、柱层析常见问题与对策柱层析成败的关键是选择合适的吸附剂、洗脱剂和操作方式。

（一一）吸附剂的