基因工程原理教案Word格式文档下载.docx

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⏹DNA分子的体外连接

⏹将外源DNA导入宿主细胞

⏹目的基因的筛选和鉴定

（四）基因工程的历史及我国开展基因工程的现状

第二章基因工程的基本操作技术

PCR技术和基因定点诱变技术。

包括PCR技术的原理，反向PCR与染色体步移，不对称PCR与DNA序列测定，PCR与RAPD，RT-PCR与RNA分析；

基因定点诱变的原理，盒式诱变，寡核苷酸引物诱变和PCR诱变。

酶学测序的原理和程序，基因化学合成的原理和程序。

（一）凝胶电泳技术

在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。

将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极→正极移动。

Ø

琼脂糖凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳

脉冲场凝胶电泳

RNA电泳

（二）细菌转化技术

▪转化作用就是一种基因型细胞（感受态细菌）从围介质中吸收来自另一种基因型细胞的DNA,进而使原来细胞的遗传基因和遗传性发生相应变化的现象。

▪提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株则称做受体菌株。

常见转化法有原生质体转化法；

化学转化法；

电穿法

（三）核酸杂交技术

▪所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。

▪Southernblot；

Northernblotting；

斑点印迹杂交和狭线印迹杂交；

菌落原位杂交

注意比较

（四）DNA序列分析技术

（四）DNA测序分析

▪DNA链末端合成终止法：

DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成准确的DNA互补链；

②该酶能够用2'

，3'

--双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3'

-末端，从而终止其延伸反应。

在DNA测序反应中，加入模板DNA，引物（特异性引物，如T7，T3，M13等），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC和一种ddNTP。

常用Klenow大片段，无5'

→3'

外切酶活性。

▪Maxam-Gilbert化学修饰法（哈佛大学）：

该法的基本原理是用化学试剂处理具有末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割并产生一组具有不同长度的DNA链降解产物，经凝胶电泳分离和放射自显影之后，可直接读出待测DNA片段的核苷酸序列。

▪DNA杂交测序法（SBH-Sequencingbyhybridization）：

如果一段较短的DNA探针能与较长的DNA片段杂交，并形成完全的双链结构，我们就推测在靶DNA上存在着相应的互补序列，这就是DNA杂交测序法的基本原理。

用一组已知系列的寡核苷酸短序列做为探针，同某一较长的靶DNA分子杂交，从而测定其序列。

（五）基因的化学合成

（六）PCR技术

▪PCR反应体系的设立

▪PCR反应程序设计

▪引物设计原理

▪PCR技术应用

（七）基因定点诱变技术

使已克隆基因或DNA片段中的任一个特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过程叫作基因的定点诱变，是基因工程和蛋白质工程的重要手段。

▪盒式诱变（cassettemutagenesis）包括盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两种式。

▪寡核苷酸引物诱变应用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段做引物，进行DNA复制，使寡核苷酸引物成为新合成的DNA子链的一个部分

▪PCR诱变：

重组PCR定点诱变、大引物诱变

（八）DNA与蛋白质相互作用

▪凝胶阻滞实验（Gelretardationassay），又称DNA迁移率变化试验（DNAmobilityshiftassay，DMSA）：

DNA与蛋白质结合后分子量变大，改变了迁移率，由此判断DNA是否与蛋白质发生结合

▪DNaseI印迹试验（DNaseIfootprinting）用于检测与蛋白结合的DNA序列的部位及特性，形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域。

▪甲基化干扰实验：

根据DMS（硫酸二甲酯）能够使G残基甲基化，而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的G残基这一原理。

这种技术可以检测靶DNA中特异G残基的优先甲基化对于此后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细地揭示DNA与蛋白质之间相互作用的模式。

DMS化学干扰的主要局限性时，它只能使G残基甲基化，但仍不愧为足迹实验的一种有效的补充手段，可以鉴定足迹区段中DNA与蛋白质相互作用的精确位置。

第三章基因工程的工具酶

限制性切酶、DNA连接酶和DNA聚合酶的生化特征、作用原理和应用领域。

包括Ⅱ型限制性切酶，T4DNA连接酶，大肠杆菌DNA连接酶，大肠杆菌DNA聚合酶I，Klenow酶，T4DNA聚合酶，T7DNA聚合酶，反转录酶，TaqDNA聚合酶，PfuDNA聚合酶和反转录酶。

T4多核苷酸激酶、碱性磷酸酶和末端转移酶的作用原理和应用领域。

切口转移与核苷酸标记技术

（一）限制性切酶和甲基化酶

⏹在DNA双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子，产生链的断裂。

两个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的因此，断裂的结果形成的DNA片断，也往往具有互补的单链延伸末端。

（二）DNA连接酶

⏹能够将DNA链上彼此相邻的3’-羟基（OH）和5’-磷酸基团（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯键。

⏹只能连接切口（nick），不能连接缺口（gap）。

而且被连接的DNA链必需是双螺旋DNA分子的一部分。

（三）DNA聚合酶

1、E.coliPolI的特点

（1）具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具5’→3’外切酶活性，大片段具3’→5’外切酶活性和聚合酶活性（大片段亦称为Klenow片段）。

（2）聚合酶活性

5’→3’,要求3’-OH引物和模板DNA，其延续性受反应条件的影响

2、Klenow片段

由大肠杆菌DNA聚合酶经枯草杆菌蛋白酶的处理之后，产生出来的大片段分子。

仍具有5’→3’的聚合酶活性和3’→5’的外切酶活性，失去了全酶的5’→3’外切酶活性。

3、T4DNA聚合酶

从T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出的一种特殊的DNA聚合酶，具有5’→3’的聚合酶活性和3’→5’外切酶活性。

5’→3’聚合酶活性，1500nt/min,为PolI的两倍

3’→5’外切酶活性，可作用于ssDNA和dsDNA，其切除速度分别为40和4000nt/min

4、反转录酶

⏹多RNA肿瘤病毒中分离到这种酶，最常用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒的反转录酶（AMV）

⏹AMV具有α链和β链；

α链具有聚合酶活性和RNaseH活性；

β链具有以RNA-DNA杂交分子为底物的5’→3’脱氧核酸外切酶活性

5、T7DNA聚合酶

⏹1978年，S.Tabor从感染了T7噬菌体的大肠杆菌寄主细胞中纯化出来的一种聚合酶。

⏹加工形式的T7DNA聚合酶系：

T7噬菌体编码的基因5蛋白质，另一种是大肠杆菌编码的硫氧还蛋白。

⏹基因5蛋白质：

具有聚合酶活性和3’→5’外切酶活性；

硫氧还蛋白：

增强基因5蛋白质与模板引物的结合力

⏹具有5’→3’的聚合酶活性和很高的单链及双链的3’→5’核酸外切酶活性。

（四）DNA和RNA修饰酶

1、末端脱氧核苷酸转移酶与同聚物加尾

⏹末端脱氧核苷酸转移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase），从小牛胸腺中纯化出来的一种小分子量的碱性蛋白质，在二甲胂酸缓冲液中，能催化脱氧核苷三磷酸进行5’→3’向的聚合作用，逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性DNA分子的3’-OH末端。

2、T4多核苷酸激酶

⏹由T4噬菌体的pseT基因编码的一种蛋白质，最初从T4噬菌体感染的E.coli中分离出来。

作用：

催化γ-磷酸从ATP分子转移给DNA或者RNA的末端，不受底物分子链的长短限制。

3、来自于大肠杆菌（bacterialalkalinephosphataseBAP）或小牛肠（calfintestinalalkalinephosphataseCIP），

⏹用于脱去DNA（RNA）5’末端的磷酸基团，使5’-P成为5’-OH，该过程称核酸分子的脱磷酸作用。

当需要5’端同位素标记或为了避免DNA片段自身连接（或环化）时可进行脱磷酸反应。

（五）核酸外切酶

第四章原核生物基因工程的载体

大肠杆菌质粒载体，包括pBR322和pUC18/19载体构建原理和应用领域，蓝/白筛选，质粒DNA的制备和纯化；

λ噬菌体载体，包括λgt10/11和λEMBL3/4载体构建原理和应用领域，λ重组噬菌体的筛选；

M13噬菌体载体，M13mp18/19构建原理和应用领域，单链DNA的制备；

粘粒载体pJB8构建原理和应用领域。

λ重组DNA的转移和筛选

（一）质粒

质粒是细菌细胞携带的染色体外的DNA分子，是共价闭合的环状DNA分子（covalentclosedcircular，DNAcccDNA），大小在1~200kb，能独立进行复制。

1、氯化铯密度梯度离心

▪质粒DNA占总DNA的1%～2%；

▪在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子量的细菌染色体易断裂成线性片断，而质粒DNA分子量小，结构紧密仍保持完整的状态；

▪染色剂溴化乙锭（EB）能掺入到DNA链的碱基中，导致链的解旋；

而且形成的EB-DNA复合物中，EB含量越高，密度会越低。

2、碱变性法

▪根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来的。

▪在pH值12.0～12.5围时，线性的DNA会被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会被变性。

▪通过冷却或恢复中性pH值使之复性，线性染色体形成网状结构，而cccDNA可以准确迅速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒DNA

3、质粒载体必须具备的基本条件

▪具有复制起点

自我增殖的基本条件，一般具一个复制子。

协助维持细胞含有10～20个左右的质粒拷贝

▪具有抗菌素抗性

▪理想的质粒载体具有两种抗菌素抗性基因。

以便为寄主细胞提供易于检测的表型性状做为选择信号，而且在有关的限制酶位点上插入外源DNA后形成的质粒有一个选择标记。

▪具有若干限制酶切单一位点（MCS）；

▪具有较小的分子量和较高的拷贝数。

低分子量的质粒易于操作，克隆外源片断后（不超过15kb）仍能有效的转化给受体细胞同时低分子量的质粒对限制酶具有多重识别位点的几率也较低；

较高的拷贝数可获得大量的克隆基因

（二）噬菌体载体

1、λ噬菌体的基因组结构

（1）cos位点

▪线性双链DNA分子两端各有一条12nt组成的彼此完全互补的5’突出单链

▪注入宿主后，粘性末端互补形成双链区，成为cos位点。

2、插入式载体

▪λ噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所以一般用于cDNA文库或基因组文库的构建。

3、λ替换型载体（取代型载体）

外源DNA取代噬菌体染色体中对于噬菌体的感染和复制非必要的片段