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脂肪氧合酶及其对小麦品质的影响

脂肪氧合酶及其对小麦品质的影响

摘要：

小麦脂肪氧化酶活性及其对品质改良的作用是当前国内外关注的课题之一。

本文综述了脂肪氧化酶类型及性质、其影响因素和测定方法、脂肪氧化酶对小麦加工品质和储藏品质的影响等。

关键词:

小麦；脂肪氧化酶；储藏品质；加工品质

Abstract：

Activityoflipoxygenaseanditseffecttowheatqualitywasoneoftheprogramsconcernedwithsomescholarathomeandabroad．Thetypesandcharacteristicsaswellastheinfluencingfactorsandtestingmethodsoflipoxygenase,　effectoflipoxygenaseonwheatmillingandstoringqualitiesetc.werereviewed.

Keywords：

wheat；lipoxygenase；storagequality；processingquality

脂肪氧合酶（Lipoxygenase,LOX,EC1.13.11.12）属于氧化还原酶，是一类含非血红素铁的蛋白质,能专一催化具有顺，顺-戊二烯结构的多不饱和脂肪酸及酯，通过分子内加氧，形成具有共轭双键的氢过氧化衍生物[1]（脂肪氧合酶的酶学特性及其活性抑制机理的研究进展）。

LOX广泛地存在于动植物界中，最普通的天然底物是亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸。

1932年Andre和Hou首先发现大豆蛋白制品产生豆腥味是因为其中多元不饱和脂肪酸发生酶促反应的结果，其中关键的酶就是脂肪氧合酶。

1947年Theoren等首次从大豆中获得了脂肪氧合酶的结晶，相对分子质量为10.2万[2]。

（植物中脂肪氧合酶的研究进展）

LOX催化多不饱和脂肪酸的氧化,产生氢过氧化合物,氢过氧化合物通过均裂或β-裂变分解，就形成了醛、酮等二级氧化产物,氢过氧化合物进一步裂解成不饱和的醛类、酮类和醇类化合物，形成类似苹果、香瓜、芒果等水果风味以及鲜鱼味、牡蛎味、文蛤味和海藻香、青草香等挥发性风味物质（小球藻脂肪氧合酶酶学性质研究）[3]。

另一方面，产生的的氢过氧化物也可以进一步氧化可以转化为环氧酸。

这些氧化产物导致果蔬加工制品产生不良的风味,比如说大豆及其制品的豆腥味,以及油脂和含油食品在贮藏和加工过程中的色、香、味发生劣变等。

除此之外，脂质降解是小麦等粮食储藏期间变质,产生陈味劣变主要内在原因，而脂肪氧化酶活性是影响小麦储藏特性的重要因素之一[4]（脂肪氧化酶及其在小麦品质改良中的研究与应用）。

1脂肪氧化酶的结构与作用机制

1.1脂肪氧合酶活性中心结构

LOX的来源不同,其氨基酸的组成不同。

目前已研究发现2种大豆脂肪氧合酶同工酶和1种鼠网织红细胞中的脂肪氧合酶的晶体结构,其中大豆脂肪氧合酶（LOX-1）具有839个氨基酸残基[4]。

虽然植物脂肪氧合酶的氨基酸残基数目和动物脂肪氧合酶的有所不同,但它们的氨基酸序列在某些区域内有很大的相似性,因而其催化反应的机理基本相同。

脂肪氧合酶活性部位的结构尚不完全清楚,其活性部位的基团可能含有铁、芳香族氨基酸残基和蛋氨酸残基等。

大豆LOX-1模型中[6],铁离子中心含有5个内源配体和1个外源配体。

内源配体包括三种组氨酸残基（His499,His504,His690）,一个Ile839残基以及一个Asn694，外源配体为水分子。

1.2脂肪氧化酶的作用机制

1.2.1自由基学说

尽管脂肪氧合酶具体反应机制仍在重点探讨，但其中游离自由基学说取得一致认可。

脂肪氧合酶反应包括三个连续阶段：

（l）从双等位亚甲基中立体选择性移去氢原子；

（2）在与Z，E一二烯烃结合中，游离自由基发生重排；（3）立体特异性接入氧，氢过氧化自由基还原为相应阴离子。

从立体化学角度考虑每个阶段可通过不同途径进行[5]。

1.2.2过氧化机制

关于脂肪氧合酶过氧化催化机制人们提出不少假设，在这些假设中，包括两种不同途径：

好氧反应和厌氧反应，它们可能同时发生。

氢过氧化物产生包括三个步骤：

（l）天然酶激活；

（2）从活化亚甲基中移去一个氢原子；（3）将氧接入底物分子中产生氢过氧化物。

每分子脂肪氧合酶都含有一个非血红素铁原子，在大豆脂肪氧合酶中这个铁是高自旋的，常以两种氧化态：

Fe2+（非活性形式）和Fe3+（活性形式）中一种状态存在。

在绝大多数脂肪氧合酶接触催化反应中，铁在Fe2+和Fe3+之间变动，但铁原子很难离开大豆脂肪氧合酶[6]。

脂肪氧合酶作用机制可用大豆脂肪氧合酶同工酶LOX-l作用于底物亚油酸（ROOH）来解释。

脂肪氧合酶处于未活化状态时，酶分子中Fe以还原态存在；酶与微量13-L-ROOH（13-L-亚油酸的氢过氧化物）作用即转变成活化态，此时酶分子中Fe以氧化态形式存在。

活化态脂肪氧合酶作用于亚油酸第一步是以C-11立体有选择取走一个氢。

LOX-1作用机制中，酶取走H-LOX，产生黄色亚油酸自由基—酶络合物自由基—酶络合物，有可能伴随发生O2被活化成O2-过程。

O2通过“反面”机制接到亚油酸分子上被取走的H-LOX相反一侧，氢过氧化亚油酸游离基从酶分子中Fe取走一个电子和从介质中得到一个质子形成13-L-亚油酸氢过氧化物（13-L-氢过氧化-18-顺-9，反-11-二烯酸）时，双键从C-12移动到C-11，构型从顺式转变成反式。

在pH=9时，大豆脂肪氧合酶同工酶LOX-1以亚油酸为底物的主要产物是13-L-ROOH。

除外，还可能产生其它三种异构体:

13-D-ROOH（13-D-氢过氧化-18-顺-9，反-11-二烯酸），9-D-ROOH（9-D-氢过氧化-18-反-9，反-10-顺-12-二烯酸）和9-L-ROOH（9-L-氢过氧化-18-反-10，反-12-二烯酸）[7]（大豆脂肪氧合酶研究进展）。

1.3脂肪氧合酶的底物特异性

LOX对它作用的底物具有结构特异性的要求。

含有顺，顺-戊二烯结构的不饱和脂肪酸、脂肪酸酯都可以作为LOX的底物。

在植物中其天然底物主要是亚油酸（Linoleicacid）和亚麻酸（Lionlenicacid）,在动物体内其天然底物主要是花生四烯（Arachidonicacid）。

LOX的来源不同,底物的不同，都会导致其加氧的位置有所不同，因而产物也就有所不同。

LOX-1的底物为不饱和脂肪酸,生成13-氢过氧化合物,LOX-2的底物为酯化底物,生成9-或13-氢过氧化合物。

2脂肪氧化酶对小麦品质的影响

2.1脂肪氧化酶对加工品质的影响

TrufanovVA等研究表明，LOX活性与面团强度呈显著负相关；LOX活性与形成时间、稳定时间呈显著负相关，与粗面筋含量、吸水率和延伸性呈负相关，与弹延比呈正相关；适当的LOX活性有利于氧化小麦粉的色素，使小麦粉变白,提高其商品性，但过高的LOX活性则氧化了小麦粉中的类胡萝卜素及维生素A等,造成小麦粉过白，而失去了许多营养成分。

因此,较低的LOX活性有利于保存小麦粉及其制品的营养成分。

LOX对面筋品质的作用机理：

面筋品质与二硫键的含量密切相关，二硫键是贮藏蛋白质中面筋蛋白质大分子团得以稳定的分子结构。

在小麦贮藏蛋白质中,巯基/二硫键（SH/—S—S—）状态的形成受酶的调节，其中一个重要的酶就是LOX。

LOX可以氧化蛋白质分子中半胱氨酸的二硫键（—S—S—）,包括分子间和分子内二硫键,从而使不饱和脂肪酸发生氧化作用。

LOX不同异构体的作用与小麦贮藏蛋白质巯基基团的氧化特性、面筋品质中若干性状的变化具有不同程度的关联。

LOX异构体表面电荷低时，对面筋品质的影响最大。

2.2　脂肪氧化酶对储藏品质的影响

BorrelliGM等研究表明，降低LOX活性有利于延长杜仑小麦籽粒、通心粉和通心面等的保存期，进而提高产品的附加值，其他研究者对普通小麦的研究得出了相似的结果。

另一些研究认为，低活性LOX或LOX缺失体可以有效减轻脂质的氧化反应，减轻籽粒的氧化变质,从而延长其储藏期，减少粮食的浪费。

同时,降低LOX活性被认为是长期保存种子的重要方法之一,这比冷冻储藏更加可行。

3脂肪氧化酶的酶活力测定

3.1量压法

量压法的测定原理是利用脂肪氧合酶催化底物亚油酸与氧结合形成氢过氧化物,使得一定体积的密闭体系内氧气的量减少,在温度恒定的条件下,体系的气体总压下降。

根据密闭体系的总气体体积和测定得到的气体压力变化值，运用气体状态方程就可以计算出反应的耗氧量，耗氧量与酶反应强度线性相关[8]（3种脂肪氧合酶酶活测定方法）。

该法的主要优点是测定参数与反应体系浊度无关,因而既适用于纯酶也适用于粗酶酶活力的测定,但由于测定时需不断振动反应瓶以保持底物的乳化和温度的恒定，酶活力会因振动而部分损失。

3.2分光光度法

与量压法不同,分光光度法测定的是酶催化反应的初期产物.脂肪氧合酶催化底物亚油酸反应生成的初期产物具有共轭二烯的结构,而共轭双键在234nm处有特征吸收,通过测定反应体系在234nm处的吸光度可以定量生成的共轭二烯量，并推算出酶活力.该法的显著优点是可连续测定，但受分光光度法测定体系不能有浊度的限制，不适用于浊度较高的粗酶液酶活力的测定,比如未脱脂的大豆提取液。

3.3KI-淀粉法

KI-淀粉法测定的基本原理是基于脂肪氧合酶催化亚油酸反应形成的氢过氧化物在酸性条件下可氧化I-形成I2,而I2与淀粉结合可呈现出介于兰、紫和褐色之间的颜色，在470nm处有特征吸收。

吸光度的大小直接反映生成的I2量，因而可以间接定量脂肪氧合酶酶活力的大小。

与上述分光光度法一样，KI-淀粉法的测定同样受到酶液浊度的制约，而且由于显色是在酸性条件下进行的，酶液中存在的蛋白质和脂肪在酸性条件下会絮凝，若采用离心的方法虽能除去絮凝但同时会使部分有色物质的沉淀，从而影响测定结果的可靠性。

因此,该法不适合于粗酶提取液酶活力的测定。

3.4氧电极法

氧电极法的工作原理与量压法相似，通过测定恒温密闭体系中氧电极电位的变化，定量脂肪氧合酶催化底物亚油酸发生氧合反应所消耗的氧气，并以初始耗氧速度作为酶活力单位[9]。

这种方法的优点是可连续记录反应进程，适用于纯酶和粗酶提取液的动力学研究，但由于对仪器温控和密闭性要求苛刻，限制了此法的广泛使用。

3.5Fe（CNS）3显色法

Fe（CNS）3显色法与KI-淀粉法相似，是利用酶反应初期产物能氧化Fe（CNS）2生成有色化合物的特性，采用分光光度法定量测定酶活力，该法存在的主要问题是Fe（CNS）3不稳定，而且呈现的色值和Fe（CNS）3的量之间缺乏良好的线性关系。

4脂肪氧合酶的活力抑制

4.1物理方法

脂肪氧合酶化学本质是蛋白质，除受pH、离子强度和有机物质等多种外界因素影响外，还容易受到加热、高压等因素影响。

由于脂肪氧合酶占大豆总蛋白含量的1%—2%，而小麦中脂肪氧合酶含量相对较低，故常以大豆脂肪氧合酶作为研究模型。

4.1.1加热

鄢全等[10]采用干热方法对脱脂豆粕中脂肪氧合酶进行灭活处理，研究发现，影响脱脂豆粕灭酶处理主要因素是干热灭酶温度、加热时间和豆粕含水量。

其中水分含量对豆粕酶活性影响极大，在低水分含量下，加热很难使脂肪氧合酶活性下降。

如在3%水分含量下，100℃加热30min仅使酶活下降至原来一半；而当水分含量为10%左右，即正常状态含水量时，灭酶能使酶活下降至原来1/8；当水分含量升至12%后，水分进一步增加已基本不再使酶活进一步降低。

随灭酶温度升高，酶活呈现先稍微升高再逐渐下降趋势，且当温度超过80℃后，酶活下降速度很快，到100℃时加热30min，酶已基本失活。

这说明脂肪氧合酶在较低温度下有可能存在一个激活态，50℃—60℃会使大豆粕中酶激发出更高活性。

在100℃下，随着加热时间延长，脂肪氧合酶活性逐渐下降：

当加热时间超过30min后，大豆粕残余酶活已很低。

尽管加热处理能有效钝化脂肪氧合酶，同时其它蛋白质（如大豆蛋白质）会因加热而变性，使其功能质和溶解性降低，一些风味、色泽、维生素和营养成分也受到很大损失。

微波加热技术对小麦胚芽中脂肪氧合酶灭活与蒸汽和热水加热方法相比，它不仅速度快，效果好，能耗低，方便调控，还有利于其后续加工改善，如有助于提高小麦胚芽出油率[11]。

4.1.2高压

高压处理与加热相比是一种灭酶较好方法，高压处理能灭活除抱子外多种微生物，还能最大限度保存食品风味、颜色、维生素和营养成分。

Ludikhuyze等利用高压和凝胶电泳技术对大豆脂肪氧合酶进行灭活和变性研究，大豆脂肪氧合酶在64℃时加热，随着时间延长，凝胶电泳条带颜色变浅表明脂肪氧合酶浓度降低，代表酶天然结构部分发生变化。

基于以前对大豆脂肪氧合酶压力稳定性研究，压力设定在500—650MPa之间，在常温下酶活性明显降低，但凝胶电泳条带浓度变化不大，说明对酶的天然结构破坏很小。

当压力增加到600—800MPa时，由于凝胶电泳条带颜色很浅，可推断酶的天然结构破坏很小。

由于酶活性位点构象微小变化便会引起酶活性丧失，但并不怎么影响天然酶结构，可知大豆脂肪氧合酶对热或压力变性抵抗力比对热或压力灭活更强。

4.2化学方法

4.2.1抑制机理

通过对LOX抑制剂的研究,其抑制机理可以分为与底物竞争酶的活性部位、鳌合作用、还原作用和竞争脂质自由基等,另外还有一些抑制剂的抑制机理尚不清楚。

⑴与底物竞争酶的活性部位

此机制是指抑制剂可以作为底物参与反应,从而抑制LOX活性。

例如,Vc对LOX活性的抑制作用是作为LOX氧化反应的底物,其在500μmol/L可以抑制LOX活性的70%。

不过Roy和Kulkarni[12]认为Vc是自由基清除剂。

⑵鳌合作用

在脂肪氧合酶中铁以两种状态存在,Fe2+状态是非活化态,只有转变成Fe3+才具有催化活性。

抑制剂与Fe2+发生鳌合作用后,将保持其非活化状态。

罗勒和山奈的提取物对LOX存在抑制作用,其IC50分别为20.63、27.52μg/mL，同时它们是Fe2+鳌合剂，其鳌合能力和提取物的浓度之间存在着线性关系，提取物的浓度越大，鳌合能力越强。

这两种提取物在抑制LOX的过程中可能是作为亚铁的鳌合剂，它们可能是通过与活性中心Fe2+相互作用，从而导致酶的失活。

芸香苷、儿茶素以及咖啡酸等也是Fe2+鳌合剂，同时也对LOX有抑制作用。

⑶还原作用

从其催化机制中可以知道,Fe2+是不具备催化活性的，只有Fe3+有催化活性。

因而当Fe3+被还原成Fe2+时，其活性会受到抑制。

硒化物可以抑制LOX,从电子自旋共振（ESR）图谱中观察到铁活性部位会由于硒化物而改变,Fe3+可以接受硒化物的电子,转变成Fe2+。

这表明硒化物很可能是还原铁离子，同时改变非还原铁离子的状态。

去甲二氢愈创木酸是一种有效的LOX抑制剂，其抑制机理也是将Fe3+转变成Fe2+[13]。

⑷竞争脂质自由基

有一些抑制剂可能是和催化过程中的自由基发生反应,从而使链式反应终止。

Serpen等认为在β-胡萝卜素抑制LOX的过程中，β-胡萝卜素的添加可以减小LOX催化反应过程中共轭二烯基的生成速率。

β-胡萝卜素是在链反应开始时和亚油酸自由基（L·）反应，转变成它的初始状态（LH），因此酶就不能完成链反应。

与β-胡萝卜素抑制机理相似的还有栎精，它在40μmol/L时具有最大的抑制作用，此时可以抑制LOX活性30%。

4.2.2化学抑制剂

叔丁基茴香醚（BHA）、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）是人工合成的效果较好的油脂抗氧化剂,它们同样可以有效的抑制LOX活性。

NaN3、Vc可以抑制大豆LOX的活性，NaN3在500μmol/L时可以抑制其活性的90%，Vc在500μmol/L抑制其活性的70%。

亚硒酸盐可以有效的抑制人体单克隆B-淋巴细胞中的5-LOX,在亚硒盐抑制LOX的过程中，是亚硒盐被氧化后的硒化物起着抑制作用，这种抑制作用是不可逆的。

4.2.2天然提取抑制剂

⑴儿茶素

儿茶素对脂肪氧合酶活性的影响。

茶叶中富含儿茶素,用水从绿茶中提取，经过分离纯化后可以得到表儿茶素（Epicatechin，EC）、表儿茶素没食子酸酯（Epicatechingallate,ECG）、表没食子儿茶素（epigallocatechin，EGC）和表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechingallate，EGCG）四种物质。

这四种物质能够抑制LOX,其中ECG、EGCG具有较高的抑制能力,而EC、EGC相对较弱,这可能是由于它们结构的差异所导致的。

其动力学研究表明,它们与一般的非竞争性抑制有所不同，在Km减小的同时Vmax却增大。

⑵黄酮类　

类黄酮和异黄酮同样能够抑制LOX。

Jun等从野葛根中提取的5种异黄酮和异黄酮糖都能抑制LOX的活性,在50mmol/L时抑制活性能力最强,抑制LOX达到70%左右。

Kim等从大蒜叶中分离出三种黄酮醇,栎精、异槲皮苷和瑞诺甙，其IC50分别为16.9、40.1、32.9μmol/L。

⑶花青素类　

原花青素是广泛存在于植物中的一类物质,用丙酮/水从莲房中提取的原花青素中含有单体、二聚体、四聚体，其中二聚体含量最高。

62.5μg/mL原花青素可以抑制LOX90%以上的活性,其IC50值是21.6μg/mL，在62.5～500μg/mL的范围内，抑制活性没有明显的变化。

⑷小分子肽或蛋白质

　目前有关小分子肽和蛋白质抑制LOX活性的研究较少。

大豆分离蛋白经中性蛋白酶ASI.398水解，超滤分离得到具有抗氧化活性的大豆肽。

大豆肽在0.1～500mg/mL浓度范围内对大豆脂肪氧合酶有明显的抑制作用,在低浓度0.1～0.5mg/mL与高浓度250～500mg/mL下抑制率较高，均大于90%，而在中等浓度1～100mg/mL下抑制率较低,均不到80%[14]。

SimoLaakso等[15]推测酪蛋白可能具有诱导或改变酶的功能。

牛奶对LOX也表现出一定的抑制作用,这种抑制作用与牛奶的热加工、透析无关，而与酪蛋白部分有关。

但是其抑制效果并不是由于酪蛋白作为底物吸收，也不是由于钙离子的作用。

Rival等[16]研究表明,α-，β-，γ-酪蛋白以及全酪蛋白都具有此抑制能力，β-酪蛋白以及全酪蛋白的水解产物也同样具有抑制作用。

酪蛋白以及酪蛋白肽同时可以抑制非酶脂质过氧化，其抗氧化能力可能与氨基酸序列有关,即所谓的结构功能关系。

⑸其他

没食子酸也是常见于植物中的一种物质，它不仅可以有效的抑制脂质过氧化,还能抑制大豆LOX-1的活性，IC50是1.3μmol/L，动力学分析表明它是一种竞争性抑制剂。

柑桔的提取物同样具有抑制能力。

YoichiNogata等比较42种柑桔，2种金橘和一种枸桔提取物对LOX活性的抑制，在这三种不同的属中，柑桔表现出最高的抑制能力，其IC50为24μg/mL，其外皮的提取物也表现出具有抑制LOX活性的能力。

啤酒中的黑色素、饴糖和黑麦芽有较高的抑制LOX的活性作用，与黑色素和饴糖相比,黑麦芽具有更高的抑制活性作用。

在4%（w/w）的浓度时，黑麦芽可以抑制的活性达80%左右，而黑色素在此浓度时是促进作用，饴糖抑制的活性为20%左右。

5.讨论

由于脂肪氧合酶对油脂的氧化作用导致小麦质量的下降，及储藏期缩短，因此对脂肪氧合酶的抑制方法研究具有重要的理论和现实意义。

我国目前对脂肪氧合酶的研究起步较晚，发展较为迟缓，其动力学研究、分子生物学研究以及抑制机理是今后应重点加强的基础理论研究。

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